Analiza imunohistochimică și biologică celulară a anticorpilor monoclonali umani împotriva carcinoamelor colorectale

De la Institutul Patologic al Universității din Würzburg Comitetul executiv: profesorul Dr. med. H.K. Müller-Hermelink Analiza imunohistochimică și biologică celulară a anticorpilor monoclonali umani împotriva carcinomului colorectal Disertație inaugurală pentru obținerea unui doctorat de la Facultatea de Medicină a Universității Bavareze Julius Maximilians din Würzburg, prezentată de Judith Lorenz de la Fulda Würzburg, iunie 2004

Vorbitor: profesorul Dr. rer. nat. Dr. med. H.P. Co-arbitru al lui Vollmer: profesorul Dr. med. H.K. Decan Müller-Hermelink: Profesor Dr. med. S. Silbernagl Ziua examenului oral: 21 ianuarie 2005 Doctorantul este medic

părinții mei, Ulrich și Christian

Cuprins 1 Introducere 1 1.1 Carcinom colorectal 1 1.2 Anticorpi monoclonali 6 1.3 Scopul lucrării 11 2 Material și metode 12 2.1 Material 12 2.1.1 Tampoane, soluții și medii 12 2.1.2 Produse chimice și anticorpi 13 2.1.3 Anticorpi monoclonali umani 14 2.1 .4 Linii celulare 15 2.1.5 Materiale consumabile și echipamente de laborator 15 2.1.6 Software și hardware 16 2.2 Metode de imunohistochimie 17 2.2.1 Pregătirea secțiunilor înghețate 17 2.2.2 Gradientul Ficoll și pregătirea citospinelor 17 2.2.3 Colorarea imunoperoxidază a criosecțiilor și citospinelor 18 2.3 Metode de biologie celulară 20 2.3.1 Cultura celulară 20 2.3.2 Test de proliferare (test MTT) 20 2.3.3 Detecția morții celulare ELISA PLUS (Roche, Mannheim) 21

3 Rezultate 23 3.1 Colorare imunoperoxidază 23 3.1.1 Carcinoame colorectale 24 3.1.2 Țesut normal 28 3.1.3 Țesut fetal 34 3.1.4 Țesut tumoral 35 3.2 Test de proliferare (test MTT) 39 3.3 Detecția morții celulare ELISA PLUS (Roche, Mannheim) 42 4 Discuție 45 5 Rezumat 58 6 Bibliografie 59 7 Lista abrevierilor 75 Mulțumiri CV

Introducere 11 1.3 Scopul tezei În această teză, trei anticorpi monoclonali umani, care au fost dezvoltați în grupul de lucru al Prof. Dr. H.P. Vollmers de la Institutul Patologic al Universității din Würzburg cu ajutorul tehnologiei hibridomului (descris în: Vollmers și colab., 1989) au fost izolați de la un pacient cu cancer rectal, examinat cu privire la reactivitatea încrucișată cu țesut degenerat sănătos și malign. În acest scop, colorarea imunoperoxidazei a fost efectuată pe secțiuni înghețate ale diferitelor țesuturi normale și fetale și pe numeroase tipuri de tumori. Mai mult, influența anticorpilor asupra comportamentului de creștere al diferitelor linii celulare de carcinom al colonului este caracterizată in vitro cu ajutorul a două teste biologice ale celulelor funcționale (testul MTT, ELISA PLUS) Datele obținute prin prezenta lucrare ar trebui să furnizeze informații inițiale despre adecvarea anticorpilor ca agenți terapeutici pentru tumorile maligne ale colonului și, astfel, să constituie baza pentru abordări de cercetare viitoare.

Material și metode 12 2 Material și metode 2.1 Material 2.1.1 Tampoane, soluții și medii PBS: 8 g NaCl 0,2 g KCl 1,15 g Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O 0,2 g KH 2 PO 4 1 l A. bidist. Tris/NaCI: Soluție 1: 4,5 l A. redist. 40,5 g soluție NaCl 2: 1 l A. redist. Reglați 6 g tris (hidroximetil) aminometan la pH 7,6 cu HCI fumant reglați soluția 1 și 500 ml soluție 2 la pH 7,4 BSA/PBS: 5 mg BSA (albumină bovină, fracțiunea V; Roth, Karlsruhe)/ml reactiv PBS DAB: 5 ml apă de la robinet 1 comprimat DAB, 1 tabletă de peroxid de hidrogen (5 ml comprimat Sigma Fast 3,3'-Diaminobenzidină; Sigma, Steinheim) reactiv MTT: 3- (4,5-dimetiltiazol-2- yl) -2,5-difeniltetrazolium bromură (Sigma, Steinheim) 5 mg/ml PBS Lapte praf degresat: din magazinul de produse naturiste, 3 sau 5% în PBS

Material și metode 13 albastru tripan: 0,5% albastru tripan (Sigma, Steinheim) 0,9% NaCl Ser de iepure: Linaris, Wertheim-Bettingen Ser uman: de la Departamentul de Medicină Transfuzională de la Universitatea din Würzburg RPMI 1640: mediu de bază (500 ml) (PAA Laboratories, Linz/Austria) 1% glutamină (5 ml) 1% penicilină/streptomicină (5 ml) 10% FCS (ser de vițel fetal) (50 ml) preîncălziți la 37 C înainte de utilizare Trypsin/EDTA: PAA Laboratories, Linz/Austria 2.1. 2 Produse chimice și anticorpi Produsele chimice și anticorpii au fost obținuți de la următoarele companii: Detectarea morții celulelor acetonice ELISA PLUS DMSO (dimetil sulfoxid) Fico Lite H Mediu de separare Glicerină gelatină Haemalaun Tissue-Tek Mallinckrodt Baker, Deventer/Olanda Roche, Mannheim Merck, Darmstadt Linaris, Wert Merck, Darmstadt Merck, München Sakura Finetek, Zoeterwoude/Olanda Anti-Citokeratin (CAM 5.2) Reactiv Becton Dickinson, Belgia

Materiale și metode 15 2.1.4 Linii celulare Experimentele au fost efectuate pe liniile stabilite HT-29, CACO-2, COLO 206F și COLO 320. Cu excepția COLO 320, toate arată creșterea aderentă în sticla de cultură. Cultivarea a avut loc în mediu RPMI 1640/1% glutamină/1% penicilină/streptomicină/10% FCS la 37 C și 7% CO 2. 2.1.5 Consumabile și echipamente de laborator Consumabilele au fost furnizate de următoarele companii: Pipete Combitips Pahare de acoperire Camera de numărare Neubauer Diapozitive, vârfuri pentru pipete, vase de reacție și recipiente din plastic, S-monovete și canule, plăci și sticle de cultură celulară, carduri de citofiltru, Eppendorf, Hamburg, Asociația Specialiștilor Laboratori Hartenstein, Würzburg Menzel; Langenbrinck, Emmendingen Greiner, Frickenhausen; Hartenstein, Würzburg Greiner, Frickenhausen; Hartenstein, Würzburg Sarstedt, Nümbrecht Greiner, Frickenhausen Hartenstein, Würzburg Dispozitivele utilizate pentru lucrări provin de la următoarele companii: Sistem Aquabidest Incubatoare Milli-Q Plus PF Cititori ELISA Millipore, Molsheim Heraeus, Hanau Bio-Rad, München

Material și metode 16 Congelator (-70 C) Criostat 2800 Frigocut N Frigider și congelator Agitator magnetic IKAMAG Microscop RTC Microscop DMLB cu contrast de fază DMIL ph-metru ph 525 pipete pipetare ajutător banc steril acu-jet Lamin Aer Vortex-Genie baie de apă Minitherm 2 centrifugă Minifugă T Citospin centrifugă 2 Heraeus, Hanau Reichert-Jung, Nussloch Quelle, Fürth Janke & Kunkel, Staufen Leica, Wetzlar Leica, Wetzlar WTW, Weilheim i. Primar Eppendorf, Brand Hamburg, Wertheim/Main Heraeus, Hanau Bender & Hobein, Zurich/Elveția Sartorius, Göttingen Dinkelberg-Labortechnik, Neu-Ulm Heraeus, Hanau Shandon, Marea Britanie 2.1.6 Software și hardware Pentru reprezentarea grafică a rezultatelor Programele EXCEL și POWERPOINT (Microsoft, SUA) utilizate. Înregistrările fotografice ale secțiunilor de țesut au fost realizate cu ajutorul camerei digitale Nikon Coolpix 990 (Nikon, Japonia) și a microscopului DMLB (Leica, Wetzlar) în mărire de 100, 200 și 400 de ori, iar tipărirea a fost făcută pe hârtie foto (Hewlett Packard, SUA) de către o imprimantă color de aceeași marcă.

Rezultate 25 Rezultatele colorării cu HH 98/81-33-154 și HH 99/71-81-149 au fost ambele identice și atunci când acești doi anticorpi au reacționat pozitiv, colorarea cu HH 101/99-14 a fost, de asemenea, pozitivă . Acesta a fost cazul pentru un total de 7 carcinoame. Figurile 1-4 arată fiecare un exemplu de colorare pozitivă cu HH 98/81-33-154 și HH 99/71-81-149, precum și o reacție mai slabă și mai puternică a HH 101/99-14 la țesutul tumoral colorectal. Pentru comparație, reacțiile negative ale tuturor celor trei anticorpi cu țesut de colon non-neoplazic sunt prezentate în Fig. 5. a b c Fig. 1: Mărirea colonului adenocarcinomului: de 100 de ori a: control pozitiv (CAM 5.2) b: control negativ (L11/64-28) c: reacție pozitivă cu anticorpul HH 98/81-33-154

Rezultate 26 abc Fig. 2: Mărirea colonului adenocarcinomului: 10x a: Control pozitiv (CAM 5.2) b: Control negativ (RPMI 1640) c: Reacție pozitivă cu anticorpul HH 99/71-81-149 abc Fig. 3: Mărirea colonului adenocarcinomului: De 10 ori a: control pozitiv (CAM 5.2) b: control negativ (L11/64-28)) c: reacție slab pozitivă cu anticorpul HH 101/99-14

Rezultate 27 a b c d Fig. 4: Adenocarcinom al celulelor inelului care conține cecum Mărire: 200 de ori a: colorare HE b: control pozitiv (CAM 5.2) c: control negativ (RPMI 1640) d: reacție puternic pozitivă cu anticorpul HH 101/99-14

Rezultate 28 abcd Fig. 5: mărire normală a colonului tisular: de 200 de ori: control negativ (L11/64-28) b, c, d: reacții negative ale anticorpilor HH 98/81-33-154, HH 99/71-81-149 și HH 101/99-14 cu glande colonice neoplazice 3.1.2 Țesut normal Deoarece antigenele asociate tumorii recunoscute de anticorpi ar putea fi molecule care sunt exprimate și de celule sănătoase, este necesar să se identifice posibilele reacții încrucișate ale Descoperirea anticorpilor cu organe importante pentru a putea trage concluzii inițiale despre compatibilitatea anticorpilor în utilizarea terapeutică ulterioară.

Rezultate 30 Organ nr. HH 98/81-33-154 HH 99/71-81-149 HH 101/99-14 găsit. + + + Colon 3 0 3 0 3 0 3 Rectum 3 0 3 0 3 0 3 Pancreas 2 0 2 0 2 0 2 Ficatul 3 nu poate fi evaluat Splina 3 nu poate fi evaluat Timus 3 0 3 0 3 0 3 Amigdală 3 0 3 0 3 0 3 ganglioni limfatici 3 0 3 0 3 0 3 glanda suprarenală 3 0 3 0 3 0 3 rinichi 3 0 3 0 3 0 3 vezică 3 0 3 0 3 0 3 conducte deferente 3 0 3 0 3 0 3 prostată 3 0 3 0 3 0 3 testicule 3 0 3 0 3 0 3 sân 3 0 3 0 3 0 3 ovar 3 0 3 0 3 0 3 tubă uterină 3 0 3 0 3 0 3 corpus uteri 2 0 2 0 2 0 2 col uterin, portio vag. 2 0 2 0 2 0 2 piele 3 0 3 0 3 0 3 mușchi scheletic 3 0 3 0 3 0 3 placentă 1 0 1 0 1 0 1 măduva spinării 3 0 3 0 3 3 0 cortex cerebral 3 0 3 0 3 1 2 cerebel 3 0 3 0 3 3 0 Corpus pineale 2 0 2 0 2 2 0 Glanda pituitară 3 0 3 0 3 3 0 Măduvă osoasă 2 0 2 0 2 0 2 Sânge 2 0 2 0 2 0 2