Localizarea, identificarea și excizia depozitelor de țesut adipos murin

rezumat

Datorită legăturii drastice și negative dintre obezitate și alte comorbidități, cercetările privind rolul țesutului adipos în boli și sănătatea generală sunt justificate. Prezentăm un protocol pentru izolarea și îndepărtarea depozitelor de țesut adipos care permite studierea țesutului adipos utilizând metode in situ și in vitro.

Introducere

Obezele au făcut o apariție notabilă în lumina reflectoarelor media, datorită creșterii dramatice a obezității în ultimele decenii ale secolului XX. Obezitatea afectează în prezent mai mult de o treime din adulți și 17% dintre copii și adolescenți din Statele Unite (SUA) 1. În toate etniile, cercetările statistice în jurul epidemiei de obezitate au arătat că negrii ne-hispanici au cea mai mare rată a obezității ajustată în funcție de vârstă (49,5%) comparativ cu mexican-americanii (40,4%) din totalitatea hispanilor (39,1%) și a albilor non-hispanici (34,3%) 2. Impactul economic al obezității este, de asemenea, un interes tot mai mare pentru sistemul de sănătate. În 2012, s-a estimat că costul medical anual pentru îngrijirea obezității în SUA în 2005 a fost de 190,2 miliarde de dolari, aproape 21% din bugetul total al cheltuielilor medicale. Din păcate, s-a estimat că obezitatea infantilă este responsabilă doar de 14 miliarde de dolari în costuri medicale directe. Statistic, s-a stabilit că costul medical mediu al persoanelor supraponderale a fost de 2.741 dolari pe an mai mare decât cei fără această morbiditate de 3-5.

Obezitatea este un factor de risc important pentru o varietate de boli, cum ar fi: diabetul de tip 2, tulburările metabolismului lipidelor, bolile cardiovasculare, cancerul, tulburările musculo-scheletice și inflamația cronică. Obezitatea este profund legată de patogeneza sindromului metabolic și a altor boli cronice 6-8. Cu legături atât de drastice și negative între obezitate și alte comorbidități, cercetările științifice au concentrat atenția asupra epidemiei actuale și asupra rolului divers și crucial jucat de țesutul adipos pentru a înțelege mai bine.

Din punct de vedere istoric, țesutul adipos a fost considerat nesemnificativ și a fost privit doar ca un simplu țesut de umplere. În prezent, țesutul adipos s-a dovedit a juca multe roluri importante în funcția corpului: metabolismul, echilibrul hormonal, inflamația, protecția și izolarea 9. Țesutul adipos este alcătuit în principal din adipocite, dar conține, de asemenea, pericite, celule endoteliale, monocite, macrofage și celule stem pluripotente 8. Țesutul adipos este format din adipocite distribuite prin corp în diferite depozite. Principalele depozite pot fi găsite subdermic, subcutanat, intramuscular și visceral 10. Depozitele adipoase s-au dovedit a avea profiluri de substanță specifice depozitelor care au demonstrat susceptibilitatea specifică depozitului la obezitate și tulburări conexe 8.

În mod tradițional, țesutul adipos a fost clasificat în două tipuri principale: țesutul adipos alb (WAT) și țesutul adipos maro (BAT); deși literatura recentă arată prezența unui al treilea grup botezat brite sau țesut adipos bej 11. S-a demonstrat că țesutul adipos are culori diferite legate de morfologii, funcții metabolice, proprietăți biochimice și modele de expresie genetică 10. Adipocite în WAT o picătură unică, mare de grăsime și cantități variabile de mitocondrii. WATdominant găsit în localitățile subcutanate și viscerale ale corpului. WAT acționează în primul rând ca un loc de stocare a energiei și protecție a organelor. Adipocitele din BAT au o morfologie multiloculară și mitocondrii abundente. BAT se află în principal în gât și în vasele mari de sânge ale toracelui, precum și pe cele 12 omoplați. BAT funcționează în primul rând în comportamente consumatoare de energie care reglează termogeneza 7. S-a dovedit că țesutul adipos britanic sau bej împărtășește o morfologie și o expresie analogă a BAT, dar s-a constatat că provine din celulele adipoase albe 11.

Scopul protocolului este de a oferi o metodă precisă de identificare și izolare a diferitelor tipuri de depozite de grăsime din mai multe locuri anatomice.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

NOTĂ: Toate testele pe animale au fost efectuate cu aprobarea Comitetului instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) al Universității din Cincinnati și în conformitate cu Ghidul Institutului Național de Sănătate pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator (publicația NIH 85-23, Revizuit 1996).

1. Eutanasiați și sterilizați mouse-ul

Așezați mouse-ul într-o cutie de picături formată dintr-o doză suprateraputică de izofluran și lăsați efectul să inspire. Odată ce mouse-ul este ucis, scoateți-l din câmp.
Schimbați colul uterin ca al doilea mijloc de eutanasie.
Sterilizați suprafața exterioară a șoarecelui prin curățarea animalului cu 70% etanol.

2. Identificarea și izolarea a trei depozite diferite de țesut adipos

3. Izolarea țesutului adipos perivascular (PVAt)

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

Identificarea și localizarea țesutului adipos subcutanat inghinal, a țesutului adipos maro intercapular, a epididimului țesutului adipos visceral (Ilustrația 1) precum și arcada aortică, țesutul adipos perivascular, țesutul adipos aortic toracic, țesutul adipos aortic adiacent și țesutul adipos infrarenal (Figura 2) a fost realizat cu succes folosind metoda chirurgicală descrisă. Examenul histologic și diferențierea dintre specimenele BAT și WAT au fost pozitive cu colorarea hematoxilinei și eozinei (H&E) (Figura 3) evaluat. Analiza ARN-ului adiponectin (ADIPOQ), receptorului activat cu proliferatorul peroxizomului gamma (PPAR-γ), efector DFFA-inducător de moarte celulară (CIDEA) și alți markeri specifici grăsimii au fost măsurate pentru toate depozitele izolate și decupate mai sus (datele nu sunt prezentate).

Liniile celulare primare din celulele grase subcutanate și adipocitele perivasculară au fost cultivate și diferențiate de la preadipocite la adipocite cu succes pentru analiza microarray. Preadipocitele cultivate au fost convertite în adipocite cu colorare roșie ulei O (Figura 4) aprobat. Izolarea, cultura și diferențierea cu succes a celulelor grase au fost realizate pentru a fi utilizate în studii in vitro, iar activitatea proteinelor a fost măsurată cu succes. Activitatea enzimatică a matricei metaloproteazei-2 (MMP-2) a fost măsurată într-un grup de tratament comparativ cu martorul. Activitatea MMP-2 a fost determinată in situ într-o linie adipocitară perivasculară primară prin zimografie (Figura 5) măsurat.

Figura 1. Localizarea anatomică a depozitelor de țesut adipos C57BL/6 de șoarece de sex masculin. (A) depozit de grăsime a țesutului adipos maro intercapular. (B) Depozit de țesut adipos subcutanat inghinal. (C) Grăsime epididimă a țesutului adipos visceral depot.w.jove.com/files/ftp_upload/52174/52174fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Vă rugăm să faceți clic aici pentru a vedea o versiune mai mare a acestei imagini.

Figura 2. Locațiile anatomice ale depozitelor PVAt la un șoarec mascul C57BL/6. (A) Depozit de țesut adipos perivascular cu arc aortic. (B) aorta toracică depozit de țesut adipos perivascular. (C) Depozit de țesut adipos perivascular de aortă suprarenală. (D) Depozit de țesut adipos perivascular infrarenal. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

Figura 3. Colorarea H&E a țesutului adipos BAT și WAT. (A) H 8; Colorarea E a paraformaldehidei fixate, încorporate în parafină C57BL/6 probă de șoarece mascul de țesut adipos WAT la o mărire de 40X (B) Colorarea H&E a paraformaldehidei fixate, încorporate în parafină C57BL/6 probă de șoarece de sex masculin de la BAT în mărire 40X . Vă rugăm să faceți clic aici pentru a vedea o versiune mai mare a acestei figuri.

Figura 4. Colorare roșie ulei O a preadipocitelor cultivate și a adipocitelor PVAt. (A) Colorare cu ulei roșu-O a preadipocitelor perivasculară aortică cultivate la diferențierea inițială la contrastul fazei 20X. (B) Colorare cu ulei roșu-O a adipocitelor perivasculare aortice cultivate după 5 zile de diferențiere la mărire de 20X cu contrast de fază. a afișa.

Figura 5. Zimografia celulelor adipoase diferențiate, izolat din țesutul adipos perivascular, a prezentat o activitate scăzută a MMP-2 după tratament, comparativ cu celulele netratate (martor), * p Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Obezitatea poate duce la o mare varietate de comorbidități și o înțelegere deplină a rolului pe care îl joacă obezitatea nu este pe deplin înțeleasă; prin urmare, sunt necesare cercetări suplimentare în domeniul obezilor. Modelele animale, în special modelele murine, sunt ideale pentru cercetări preliminare privind progresia bolii și testarea potențialelor tratamente farmaceutice. Atunci când se utilizează aceste modele, separarea și îndepărtarea exactă a depozitelor de țesut adipos este un instrument extrem de important și necesar în studierea patologiei țesutului adipos care afectează bolile.

În literatura actuală privind depozitele obeze există un corp considerabil de literatură despre comportamentul metabolic și diferențele dintre depozitele obeze și locațiile lor anatomice. Cu toate acestea, există puține care oferă o metodă detaliată cu privire la modul de localizare, identificare și izolare specifică a acestor depozite. Pe baza revizuirii procedurilor actuale de izolare din țesutul adipos, există un subset mic de protocoale tcap pentru a furniza metodologie pentru izolarea unuia sau a două depozite la un moment dat. Cu toate acestea, acest protocol 13-14 este o tehnică precisă care permite izolarea mai multor depozite cu o cantitate minimă de preparare și contaminare, precum și abordarea diferitelor metode de examinare a specimenelor colectate.

În cadrul acestei metode există mai mulți pași care sunt critici pentru izolarea și puritatea probei. Curățarea instrumentelor, a mănușilor și a suprafețelor de multe ori pentru îndepărtarea părului și a resturilor este un pas imperativ pentru a evita contaminarea depozitului. Atunci când tăiați pielea de-a lungul perimetrului mouse-ului pentru a expune peritoneul pentru degloving, este important să nu lăsați nimic să intre prea adânc. Tăierea peritoneului va face foarte dificilă degloving și va crește potențialul de contaminare a probei. Atunci când tăiați depozitul de țesut adipos SQ, este important să identificați marginile triunghiulare ale depozitului înainte de a tăia oricare dintre adipoase. De asemenea, tăieturile trebuie făcute cu atenție pentru a evita mușchii și vasele adiacente, glandele și țesutul adipos. Acest lucru va preveni contaminarea probei de țesut gras alternativ, țesut glandular, mușchi sau sânge.

Principala limitare la izolarea și excizia depozitelor de țesut adipos în această procedură și în alte proceduri comparabile se găsește în definiția limitelor anumitor depozite. Datorită granițelor slab definite în depozite, de exemplu depozitele subcutanate, izolarea lipsei unei cantități mici de impurități din adiposul vecin poate fi dificilă. O altă limitare poate fi găsită în asigurarea că suficient de țesut este colectat la depozitele conectate vasculare pentru încercări complementare. Această limitare necesită uneori punerea în comun a eșantioanelor, deși depinde de locul de izolare și de dieta asociată animalului.

După ce depozitele de țesut adipos sunt izolate, acestea pot fi utilizate pentru o varietate de teste. Țesutul adipos poate fi utilizat pentru studii moleculare, cum ar fi expresia proteinelor, activitatea enzimei și analiza expresiei genelor. În plus, un adipocit poate izola linia celulară primară in vitro. Liniile celulare imortalizate pot fi, de asemenea, utilizate pentru studii in vitro, cu toate acestea, celulele nemuritoare nu sunt la fel de credibile ca liniile celulare separate în primul rând. În cele din urmă, țesutul adipos poate fi solid sau înghețat în TTPM pentru examinarea histologică pentru a identifica infiltrarea leucocitelor, localizarea proteinelor și caracterizarea morfologiei adipocitelor.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.