Metaloproteinazele matriciale și inhibitorii acestora în cursul pancreatitei cronice experimentale.

1 Metaloproteinaze matriciale și inhibitorii acestora în cursul pancreatitei cronice experimentale.

2 Metaloproteinaze matriciale și inhibitorii acestora în cursul pancreatitei cronice experimentale. urn: nbn: de: gbv: 28-diss

4 1 Introducere și întrebări Introducere Extragerea materialului Boli pancreatice Pancreatita acută Pancreatita cronică Modele animale de pancreatită Modele de pancreatită acută Pancreatita cerulein Dieta cu conținut scăzut de colină Modelul tripsinei Obstrucția operativă a duodenului Modele de pancreatită cronică Obstrucția operativă a duodenului de la transformarea factorului de creștere - în pancreas la șoarece transgenic supraexpresia transformării factorului de creștere - la pancreas la șoarece transgenic Șoarece transgenic cu mutant dominant-negativ al receptorului TGF tip II Pancreasul bros indus de acidul trinitrobenzen sulfonic (TNBS) Pancreatita cronică experimentală indusă de Dibutiltil diclorură celule pancreatice stelate Matrice metaloproteinaze și inhibitori de țesuturi ale matricei metaloproteinaze Fibroză, celule stelate pancreatice și matrice metaloproteinaze 16 2 Material și metode Material Substanțe chimice ADN Oligonucleotide Tampoane și soluții Kituri de culturi bacteriene Laboratoare Animale Consumabile Dispozitive Inducerea pancreatitei DBTC cronice 21 1

5 2.3 Extracția ARN din pancreas Detectarea fragmentului de control al expresiei mrna Plasmidă Amplificarea ADN a bacteriilor Cuantificarea acizilor nucleici Electroforeza ARN Transcriptaza inversă Polimeraza competitivă Reacția în lanț Electroforeza produselor PCR și evaluarea fluorescenței Pregătirea celulelor stelate pancreatice PCR a celulelor stelate pancreatice Zimografie Colecția de probe și gel de stivuire Executarea electroforezei și evaluarea colorării hematoxilinei și eozinei 32 3 Rezultate Histologia pancreatitei DBTC Ajustarea cdna prin expresia -actină a metaloproteinazelor matrice în exprimarea țesutului Expresia MMP a MMP-2 și expresia MMP a inhibitorului țesutului metaloproteinazelor matrice în țesut Exprimarea TIMP Exprimarea TIMP MMP în celulele stelate pancreatice Statistici 41 4 Discuție Cursul pancreatitei DBTC MMP MMP-9 din leucocite Relația dintre membrana bazală și sinteza MMP a MMP-9 în expresiile ARN PSC MMP-9 în pancreatita DBTC cronică Expresia ARN a MMP-2, MMP-3, TIMP-1 și TIMP-2 în pancreatita DBTC cronică Concluzii 47 2

6 5 Teze 48 6 Lista abrevierilor 51 7 Literatura 52 8 Recunoaștere 66 9 Declarația de independență 67 3

16 Figura 1: Funcțiile celulare sub influența MMP-urilor proteolitice active. (A) Degradarea ECM și migrarea celulei. (B) inducerea proliferării sau apoptozei. (C) Modularea mediatorilor și a receptorilor acestora. (D) Activarea unor proteaze suplimentare prin scindarea proenzimelor sau a inhibitorului lor (Vu și Werb, 2000). 3 Metaloproteinazele matriciale sunt un grup de peste 20 de proteaze cunoscute dependente de zinc. Acestea sunt capabile să descompună componentele esențiale ale matricei extracelulare, cum ar fi colagenul, laminina, fibronectina sau elastina. Datorită structurii lor din diferite domenii, MMP-urile pot fi împărțite în patru grupe: matrylisin, MMP-uri cu domenii asemănătoare hemopexinei, MMP-uri cu domenii transmembranare, MMP-uri cu domenii asemănătoare fibronectinei. Toate MMP-urile au o regiune necesară pentru secreție, sunt în stare latentă și au o regiune catalitică care conține situsul activ de legare a zincului. 53 Cu toate acestea, clasificarea MMP-urilor se bazează pe o împărțire în familii care rezumă substraturile MMP-urilor (Tab. 1)

18 Acest lucru se aplică și pro-enzimelor. Suprapunerea specificației este explicată de omologia secvenței de 50% a TIMP-1 și TIMP-2. 58,61 Activitatea rezultată a MMP depinde de raportul dintre MMP și TIMP în țesut. Modificările acestui echilibru duc fie la o activitate proteolitică semnificativ crescută a MMPs 59, fie la fibrogeneză crescută. 60 Denumirea TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 TIMP-4 Funcția inhibă Pro-MMP-9 și alte MMP-uri active Inhibă Pro-MMP-2 și MMP-2 active Nedefinit Nedefinit Tabelul 2: Inhibitori de țesuturi ale metaloproteinazelor matrice ( TIMP-uri) și funcțiile lor Figura 2: Cascadă de activare a metaloproteinazelor matrice de catepsină și plasmină. Activarea automată a MMP-urilor Pro de către MMP-uri active și MT MMP 1. Inhibarea degradării matricei de către TIMP-uri. (Evans și colab. 1999) 61 15

22 lungimea ampliconului TIMP 2: 453 bp TIMP 2 antisens CAA CAG GCG TTT TGC AAT GCA GA lungime: 23 bp CCC ATT GAT GCT CTT CTC TGT GA lungime 23 bp vectori pqr2 și pqr3 de la Graham M.A. Wells, Neures Limited, UK Buffers and solutions Comassie Blue solution Soluție DBTC DEPC- H 2 O 1 parte acid acetic glacial (50ml) 3 părți izopropanol (150ml) 6 părți H2O (300ml) Adăugați 0,25g Comassie Blue la 100ml (1,25g) . Se dizolvă DBTC cu 96% etanol în două părți. Apoi amestecați cu trei părți glicerol. Se incubează 1 L dh 2 O cu 1% DEPC peste noapte. Apoi dezactivați DEPC prin autoclavare. Eozină 2,5 g Eozină (nr. Indicelui de culoare) 500 ml H 2 O HBSS + FCS Mayers Hematoxilină PBS (fosfat tampon salin) poliacrilamidă electroforeză tampon 50 ml HBSS și 15 ml FCS 4%, așezați pe gheață. Următoarele sunt dizolvate în apă de 750 ml: 50 g sulfat de aluminiu (KAl (SO 4) 2 12H 2 O) 1 g hematoxilină (nr. Indicativ de culoare) 0,1 g iodit de sodiu (NaIO 3) 1,0 g acid citric 50 g clorhidrat Ad H 2 O până la 1000 ml 120 mM NaCl 170 mm NaH 2 PO 4 3 mm KCl 26 mm KH 2 PO 4, ph 7,2 3,03 g (0,025 M) Tris 14,1 g (0,152 M) glicină 1,0 g (0,1%) SDS până la 1000 ml umplut cu H 2 O. Buffer P1, Qiagen 50mM Tris ph mM EDTA Rnase A (400μg/ml) Buffer P2, Qiagen 200mM NaOH 1% SDS Buffer P3, Qiagen 2,55M KAc ph 4.8 Buffer QBT, Qiagen 750mM NaCl 50mM MOPS 15% etanol ph

23 Buffer QC, Qiagen Buffer QF, Qiagen Stop Solution Buffer Substrat Buffer TAE 1L 1M NaCl 50mM MOPS 15% Etanol Ph M NaCl 50mM MOPS 15% Etanol ph mg Orange G 2,5g Ficoll 400 EDTA 0,5M 50mmol/l Tris ph8 + 5mmol/l CaCl2 242 g Tris 57 ml acid acetic 96% 100 ml EDTA 0,5M ph8 până la 1000 ml H 2 O dist. Buffer Tris Tris-HCI 1 M în DEPC-H20, pH 7,4 Soluție Triton 2,5% 10 ml Triton + 490 ml H 2 O. Medii de cultură bacteriană Escherichia coli tulpina DH5, de la Gibco BRL (Eggenstein, Germania) a fost utilizată ca tulpină bacteriană. Mediile de cultură pentru creșterea bacteriilor au fost obținute de la Difco Laboratories, Detroit, SUA. Plăci de agar ampicilină LB Adăugați 100 mg/l ampicilină la plăcile de agar LB. Plăci de agar LB Luria Bertani (LB) - mediu 5g extract de drojdie 10g peptonă triptică 10g NaCl aqua dest. 15g agar H 2 O dist. Dublă. 1l 5g extract de drojdie 10g peptonă triptică 10g apă distilată NaCl. Se ajustează la pH 7,4 H 2 O. Redist. Cu NaOH 1 N. până la 1 l tampon de transformare 10% (greutate/volum) Polietilenglicol mM MgCl 2 în LB-Kituri medii Qiagen Miniprep Qiagen Maxiprep QIAquick Spin RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Germania Qiagen, Hilden, Germania Qiagen, Hilden, Germania Qiagen, Hilden, Germania 20