Oligomerizarea enzimatică a proteinelor alimentare sub presiune ridicată: locuri de reacție și consecințe funcționale

Oligomerizarea enzimatică a proteinelor alimentare sub presiune ridicată: locuri de reacție și consecințe funcționale DISERTATURA pentru obținerea diplomei universitare Doctor rerum naturalium (Dr. rer. Nat.) Prezentat la Facultatea de Matematică și Științe Naturale a Universității Tehnice din Dresda de Susanne Schuh Depus la 10 decembrie 2012 Disertația a fost în din septembrie 2007 până în iulie 2012 la catedra de chimie alimentară.

Disputare: 25 aprilie 2013 Recenzor: Prof. Dr. rer. nat. Dr.-Ing. habil. Thomas Henle Prof. Dr. rer. nat. Harshadrai Ravel

Cuprins Cuprins Cuprins Cuprins V Lista cu tabele VIII Lista cu abreviere XI 1 Introducere și obiective 1 2 Bazele teoretice 3 2.1 Lizozimă. 3 2.1.1 Mecanisme de acțiune ale lizozimei. 4 2.1.2 Posibile utilizări ale lizozimului. 7 2.1.3 Modificarea lizozimei. 8 2.1.3.1 Fibrile și structurile amiloide ale HEWL. 9 2.1.3.2 Funcții biologice noi prin schimbare conformațională. 13 2.1.4 Dezvoltarea evolutivă și relația cu α-lactalbumina. 14 2.2 Reticularea enzimatică. 15 2.2.1 Transglutaminaza microbiană. 15 2.2.1.1 Reacții catalizate de TGază și mecanismul de reacție. 17 2.2.1.2 Aspecte analitice. 19 2.2.1.3 Utilizarea în industria alimentară. 19 2.3 Reticulare non-enzimatică. 21 2.3.1 Reticulare indusă termic. 21 2.3.2 Legătură încrucișată în lungime zero în vid. 23 2.3.3 Utilizări posibile ale proteinelor legate neenzimatic. 23 2.4 Efectul presiunilor hidrostatice ridicate asupra proteinelor. 24 2.4.1 Efectul presiunii ridicate asupra lizozimei proteinei de pui. 26 2.4.2 Efectul presiunii ridicate asupra transglutaminazei microbiene. 27 3 Partea experimentală 29 3.1 Produse chimice, materiale, dispozitive și software. 29 3.1.1 Produse chimice. 29 3.1.2 Dispozitive și consumabile. 31 3.1.3 Materiale de examinare. 33 3.1.4 Software. 33 I.

Cuprins 4.6.2 Identificarea izopeptidelor formate. 145 4.6.3 Comparația reticulării non-enzimatice și enzimatice a HEWL.146 4.6.4 Compararea reticulării termice in-vacuo a HEWL cu β-cazeină și primele investigații pe un izolat de proteină din zer. 149 4.7 Încheierea studiilor privind reticularea enzimatică și non-enzimatică a diferitelor proteine. 152 5 Rezumat 154 6 Bibliografie 157 Publicații 172 Mulțumiri 173 Asigurări 174 IV

Lista abrevierilor LMW α-la β-lg Lys m/z Met min ML MMW MO MPa MS mtgase NRT PBS PCR pdb rel. PE RP-HPLC rpm SDS-PAGE TCA TEM TEMED TGase ThT TPCK Tris U UV Val WHO Z-Glu-Gly ZLCL probă de lizozim redus reticulat cu 1000 37 C Arnaudov și de Vries, 2005 ph 2.0; 57 C 4,0 ± 0,7> 5000 Wang și colab. 2009a ph 2.0; 55 C

10 * 1000 * Frare și colab., 2004 ph 2.0; 65 C

10 *> 600 * Cao și colab., 2004 pH 4,5; Temperatura camerei; roșu. HEWL, 90% etanol Goda și colab., 2000 90% etanol, 10 mm NaCI, 25 C * estimat utilizând imagini TEM 2-5 1000-2000

2 Noțiuni de bază teoretice În plus, Menéndez (2006) a reușit să arate că la temperaturi mai scăzute de 20 C și 600 MPa timpul necesar pentru 50% inactivare crește la aproximativ 100 min (șase ori). Mai mult, enzima este inhibată măsurabil doar la temperatura camerei de la 400 MPa sau la presiunea atmosferică de la 60 C. Pe baza acestor constatări, sensibilitatea la presiune a transglutaminazei crește odată cu creșterea temperaturilor (20 C). Inactivarea mtgazei este astfel influențată mai mult de temperatură decât de presiune și urmează o reacție de prim ordin (Lauber și colab., 2001a). Dezactivarea completă are loc la presiunea atmosferică după 2 minute și 80 C (Menéndez și colab., 2006). Inactivarea indusă de presiune se bazează pe degradarea elicoidelor α din zona suprafeței enzimei, care schimbă structura terțiară, care la rândul său afectează legarea substratului (Menéndez și colab., 2006). Spre deosebire de HEWL, replierea după tratamentul cu presiune ridicată pare incompletă, deoarece pierderea activității persistă atunci când presiunea este redusă. 28

75%, T3516 Sigma-Aldrich, Steinheim Timol 3209.1 Carl Roth, Karlsruhe Tripsină tratată cu TPCK din bovine 10.000 unități BAEE/mg Sigma-Aldrich, proteină pancreatică Steinheim, reactiv analitic T1426 acid tricloracetic (TCA) VWR, Darmstadt N-Tris (hidroximetil) metilglicină clasă analitică Serva Elektroforeză, Heidelberg (Tricin) fosfat trisodic dodecahidrat pur, pa VEB Laborchemie, Apolda Tris (hidroximetil) -aminometan (TRIS) clasă tampon, A1379 AppliChem, Darmstadt 30

3 Partea experimentală 3.1.3 Materiale de testare Tabelul 3-4: Peptide, proteine și amestecuri de proteine Denumire Specificație, nr. Catalog. Producător Lacprodan Alpha-10 (izolat proteic din zer) 45,1% α-lactalbumină 45,9% β-lactoglobulină ARLA Foods Ingrediente amba, Viby, Danemarca Aspartilizină 94,30% sinteză de Dr. M. Hellwig, TU Dresda Glutamilglicină G1970 Bachem Lizozim de la Alb de ouă de găină (HEWL)

70.000-96.500 U/mg, 62971 Sigma-Aldrich, Steinheim α-lactalbumină

85% izolare din izolat de proteine din zer (capitolul 3.4) α-lactalbumină din lapte bovin> 85% Sigma-Aldrich, Steinheim β-cazeină la Aschaffenburg (1963) Izolare de către Dr. C. Partschefeld, TU Dresda β-lactoglobulină din laptele bovin

90% (PAGE) Sigma-Aldrich, Steinheim Tabelul 3-5: Microorganisme din colecția tulpinilor Allgemeine Biochemie, Technische Universität Dresden Denumire Specificație Colorare în funcție de Gram Origine Bacillus sphaericus - probă de sol gram pozitivă Degussa (Antwerp) Bacillus subtilis - gram pozitivă Süßmuth, Universitatea din Hohenheim Escherichia coli TG 1 gram negativ necunoscut Pseudomonas putida ATCC 17390 gram negativ Institutul de Microbiologie, Universitatea din Hohenheim Streptococcus lactis B 23/2/1 gram pozitiv necunoscut 3.1.4 Software Tabel 3-6: Software folosit Analiza aminoacizilor aplicației (ASA) Electroforeză (SDS-PAGE) Măsurarea fluorescenței (test ThT, ANS) Montarea curbei de cromatografie prin permeație pe gel (GPC), spectrele UV (CD) Spectroscopia de masă (ESI-TOF-MS) Programul de hidrofobie a suprafeței (ANS) Chromstar 6.3, SCPA GmbH Totallab TL 120 v2006c, Wincats, SUA FL Solutions, Hitachi Spectre UV/VIS (roșu Congo) Aspect Plus 1.7 (1993-2000) Eurochrom 2000, Versiunea 2.05, Knauer, Geräteechnik Berlin J-700 pentru Window s Analiza standard, versiunea 1.35.01, JASCO Corp. și CDPro, metodă CONTIN Achiziție de date asistată de computer folosind ChemStation pentru LC 3D, Agilent Technologies, Böblingen Evaluation Data Explorer versiunea 4.0.0.1, Applied Biosystems, Foster City, SUA Tecan i-control TM 33

3 Partea experimentală Tabelul 3-9: Seria de concentrații pentru soluțiile de calibrare Concentrație Acid L-glutamic-γhidroxamat [mm] Soluție stoc de calibrare [µl] Tampon acetat de tris [µl] Absorbție UV λ = 525 nm 2,5 1000 0 0,742 2,0 800 200 0,578 1,5 600 400 0,441 1,0 400 600 0,295 0,5 200 800 0,146 valoare goală 0 1000 - Pentru soluția de mtgază (40 U mtgază/100 ml) aproximativ 50 mg mtgază în 10 ml 0,2 M Tris - Tampon de acetat dizolvat. Calibrare 1 ml de soluție de calibrare a fost amestecat cu 1 ml de reactiv stop și măsurat în raport cu valoarea martorului la o lungime de undă de λ = 525 nm (Figura 3-2). S-a efectuat întotdeauna o dublă determinare. Figura 3-2: Linia de calibrare: Dependența absorbției UV la λ = 525 nm de concentrația acidului L-glutamic-γ-hidroxamat 40

3 Partea experimentală Determinarea fotometrică 50 pl din soluția apoasă de probă au fost pipetate cu 950 pl NaOH într-un tub Eppendorf și amestecate cu 500 pl soluție Lowry. După 10 minute de incubare la temperatura camerei, s-au adăugat 500 pl de reactiv Folin și soluțiile au fost omogenizate. Absorbția a fost măsurată după 2 ore de incubație la 660 nm în spectrofotometrul Ultrospec 1000 (Pharmacia Biotech, Freiburg). Linia de calibrare a fost creată în aceleași condiții, cu o concentrație de 20 până la 600 µg proteină/ml (Tabelul 3-10 și Figura 3-3). Tabelul 3-10: Schemă de pipetare pentru calibrarea pentru determinarea proteinelor conform concentrației Lowry HEWL [µg/ml] Soluție stoc HEWL [µl] NaOH [µl] Absorbție UV λ = 660 nm valoare necompletată - 1000 0 20 20 980 0,066 ± 0,003 50 50 950 0,136 ± 0,015 100 100 900 0,250 ± 0,005 300 300 700 0,684 ± 0,060 400 400 600 0,827 ± 0,026 600 600 400 1,146 ± 0,032 Eșantion 50 * 950 - * 50µl din soluția eșantionului corespund unei diluții de 1:20 pe baza volumului de test Figura 3 -3: linia de calibrare, dependența absorbției UV la λ = 660 nm de concentrația de HEWL [µg/ml] 43

3 Partea experimentală Tabelul 3-15: Program de separare pentru determinarea aminoacizilor, sistem litiu Timp [min] Tampon 1 Tampon 2 Tampon 3 Tampon 4 Temperatura cuptorului pe coloană [C] 0 85 15 0 0 42 3 85 15 0 0 42 4 79 21 0 0 42 21 43 57 0 0 42 25 43 57 0 0 42 33 0 0 100 0 39 0 0 0 100 40 60 43 0 0 68 32 46 74 63 0 0 68 32 74 Identificarea și cuantificarea izopeptidelor Plantă: Pharmacia LKB Alpha Plus Coloană: coloană de cromatografie cu schimb de cationi 190 x 4,6 mm PEEK cu rășină 7 µm cu reticulare 11% Tampon de probă: Citrat de sodiu 0,2 N, pH 2,20 Volum de injecție: 20-100 µl Eluenți: vezi Tabelul 3-16 Debit: 20 ml/h Program de eluare: vezi Tabelul 3-17 Detecție: Derivatizare post-coloană cu ninhidrină, temperatura bobinei 135 C, măsurare: 570 nm Reactiv Ninhidrin: Sykam, Fürstenfeldbruck Flux de reactiv ninhidrin: 0,18 ml/min Evaluare: Chromstar 6.3 Tabel 3-16: Sistem de sodiu pentru determinarea compoziției tamponului Asp_Lys și Glu_Lys molaritatea tamponului probei pH citrat de sodiu 0,2 2,20 1 citrat de sodiu 0,2 3,16 2 citrat de sodiu 0,2 4,03 3 citrat de sodiu cu clorură de sodiu 1,2 6,14 4 hidroxid de sodiu 0,4 48

3 Parametri ai pieselor experimentale Măsurare: Mod scanare: Mod date: EX WL: EM Start WL: EM End WL: Viteză scanare: Întârziere: EX Slit: EM Slit: PMT Tensiune: Răspuns: Lungime de undă Scanare Emisie Fluorescență 370 nm 400 nm 600 nm 240 nm/min 0 s 5 nm 5 nm 700 V 0,01 s calibrare Figura 3-4: Măsurarea fluorescenței calibrării testului ANS cu 1900 µl soluție ANS (250 µm) și 100 µl probă, λ ex = 370 nm și λ em = 480 nm, HEWL netratat comparativ cu HEWL după fibrilație timp de 96 de ore (conform lui Wang și colab., 2009b) la diferite concentrații, valoarea gol a fost corectată. Creșterea ușoară a semnalului atunci când concentrația HEWL netratată a crescut s-a bazat pe faptul că reactivul au fost disponibile mai multe site-uri de legare hidrofobe. Cu toate acestea, în prezența HEWL fibrilat, s-a constatat o creștere liniară semnificativ mai puternică (Figura 3-4). 3.7.9.2 Test roșu Congo Acest test pe bază de UV/VIS a detectat creșterea absorbției unei soluții roșii Congo la 540 nm în prezența fibrilelor amiloide (Wang și colab., 2009a). 58

3 Partea experimentală Soluția stoc de tioflavină T de 100 μm a fost preparată din 1,6 mg tioflavină T (ThT) în 50 ml tampon PBS. Soluția stoc a fost apoi diluată 1:10 (v/v) cu tampon PBS pentru a obține soluția de 10 μm ThT. Implementarea 80 pl de soluție de probă de rezistență 0,05% (v/v) au fost amestecate cu 1920 pl de soluție de ThT, omogenizate și utilizate direct pentru măsurarea fluorescenței. Cu o lungime de undă de excitație de 440 nm, spectrul de emisii de la 450 la 530 nm a fost înregistrat pe spectrofotometrul de fluorescență F-4500. Intensitatea fluorescenței la 485 nm a fost utilizată pentru evaluarea matematică.Pentru a determina valoarea martorului, s-a adăugat soluție salină (pH 2,2, vezi 3.3) în locul soluției de probă de 80 µl. Parametri de măsurare: Mod scanare: Mod date: EX WL: EM Start WL: EM End WL: Viteză scanare: Întârziere: EX Slit: EM Slit: PMT Tensiune: Răspuns: Lungime de undă Scanare Fluorescență de emisie 440 nm 450 nm 530 nm 6 nm/min 0 s 5 nm 5 nm 700 V 0,01 s calibrare Figura 3-6: Calibrarea testului ThT cu 1920 µl soluție ThT (10 µm) și 80 µl probă, λ ex = 440 nm și λ em = 485 nm, HEWL netratat comparativ cu HEWL după fibrilație timp de 96 de ore (conform Wang și colab., 2009b) la concentrații diferite, valoarea martorului a fost corectată 60

4 Rezultate și discuții despre reticulare, tampoanele de 50 mm au funcționat cel mai bine, cu trimere în tamponul Bis-Tris și urme de tetramere în sistemul Tris. De asemenea, ar fi de conceput că scăderea ușor crescută a pH-ului observată în tamponul Tris-HCI de 50 mm a fost un prim indiciu al unei bune reticulări. Motivul scăderii pH-ului ca o consecință a reticulării a fost faptul că unele reziduuri de aminoacizi bazici nu mai erau accesibile solvenților după ce s-a format legătura izopeptidică. În capitolul 4.2.3 urmează o discuție cu privire la reziduurile de lizină și glutamină implicate și mediul lor. Pe baza rezultatelor diferitelor sisteme tampon, cea mai mare legare încrucișată a HEWL cu mtgase ar putea fi detectată pentru tamponul de 50 mm-tris-hcl-tampon, deci a fost ales acest lucru. Aceasta înseamnă că valorile pH-ului de la 7,2 la 9,0 ar putea fi obținute în general cu sistemele tampon bazate pe Tris, deoarece tamponul menționat este stabil în aceste limite (Good et al., 1966). În plus, valoarea de ph selectată ar trebui să fie adecvată pentru experimentele intenționate. Lizozima are un punct izoelectric (pi) de

37,5 min) și metionină (Met, Rt

43 min) aproape liniile de bază au fost detectate separat. În HEWL nativ există 78 în acest moment

4 Rezultate și discuții Figura 4-10: RP-HPLC a HEWL digerat triptic: A - HEWL netratat; B - HEWL tratat cu mtgază timp de 30 de minute la 40 C și presiune atmosferică; C - HEWL cu mtgază timp de 30 min la 40 C și 600 MPa (LMW) Tabelul 4-8: Identificarea peptidelor triptice din HEWL nativ prin RP-HPLC cu ESI-TOF-MS Timp de vârf [min] m/z triptic [M + H] + [M + 2H] 2+ peptide Masa peptidică teoretică 1 5,1 517,3-69-73 516,27 2 10,3 448,3-126-129 447,23 3 12,8 606,4- 1-5 605,36 4 13,0 874,5 437,7 15-21 873,41 5 13,5 776,4-117-123 775,35 6 14,5 1428,9 714,9 34-45 1427 .64 7 14,7 836,5-6-13 835,39 8 15,1 992,7 496 .8 6-14 991,49 9 16,5 1045,7 523,3 117-125 1044,53 10 16,9 936,5 468,7 62-68 935,37 11 17,0 1276,7 638,9 115-125 1275,64 12 17,4 1754,6 877,5 46-61 1752,83 13 19, 3 1268,7 634,9 22-33 1267,60 14 19,8 1805,1 902,6 97-112 1802,89 15 20,3 1676,4 838,5 98-112 1674,79 15 20,6 1676, 4.838,5 98-112 1674,79 I 15,7 497,3 Artefact necunoscut II 17,75 1288,9 Artefact necunoscut Modelele peptidice, care au fost detectate la o lungime de undă de 220 nm, nu au prezentat diferențe pentru lizozima nativă (Figura 4-10 A) și HEWL cu mtgază timp de 30 min 40 C sub presiune atmosferică sau presiune hidrostatică ridicată (Figura 4-10 B și C). Acest lucru a indicat faptul că cele 81 utilizate pentru tratarea HEWL

4 Rezultate și discuții A 1202,2 m/z B 817,5 m/z C 1364,9 m/z 84

4 Rezultate și discuții D 1010,7 m/z E 1507,0 m/z F 1017,7 m/z Figura 4-12: Spectre de masă ale celor șase secvențe izopeptidice identificate (A - F) după digestia triptică la diferiți timpi de retenție (vezi tabelul 4-9, tratate cu mtgază timp de 30 de minute la 600 MPa și 40 sau 60 C) și fragmentele lor izopeptidice (numerele se referă la pozițiile AA în secvența HEWL) 85

4 Rezultate și discuții despre jumătate din HEWL netratat. Gradul crescut de reticulare întârzie astfel formarea de nuclee (creștere plană) pe de o parte și creșterea fibrilelor (valoare maximă scăzută) pe de altă parte. Investigațiile privind potențialul de fibrilație confirmă așteptările exprimate anterior cu privire la a doua teorie (Johnson și colab., 2005 și Booth și colab., 1997) a unei tendințe inhibate la fibrilație. ABC Figura 4-33: Rezultatele testelor ANS, roșu Congo și ThT (A - C) cu HEWL netratat și reticulat (LMW - 2% HEWL, 40 U mtgază/g proteină la 40 C, grad de reticulare: 8,5% și HMW - 3% HEWL, 160 U mtgază/g proteină la 60 C, grad de reticulare: 65%) după incubare la pH 2,2, 55 C timp de 96 de ore starea ușor reticulată (LMW) precipită într-un precipitat fin și tulbure, în timp ce HEWL netratat formează agregate grosiere (Figura 4-34). În soluția HEWL foarte reticulat (HMW), nu a fost vizibilă nicio precipitație în niciun moment, în ciuda semnalelor ușor în creștere, iar concentrația de fibrilă necesară precipitării nu a fost probabil atinsă. 119

11) se poate realiza după patru cicluri cu sau fără vid. 4.6.2 Identificarea izopeptidelor formate După o reticulare termică cu succes cu și fără utilizarea vidului (ZLCL), ar trebui clarificată problema isopeptidelor implicate. După cum sa menționat deja, teoretic ar putea apărea două dipeptide diferite (Simons și colab., 2002). Din lizină (Lys) și 145