11-21% carbohidrați 01% grăsimi 0,1 2% proteine. 2% fibre dietetice 72% apă aminoacizi, vitamine și minerale. Cartofi aminoacizi 2%

Aplicarea adsorberilor de membrană și a sistemelor de screening pentru procesarea țintită a proteinelor din cartof Thomas Scheper, Alain Graf, S. Beutel, M. Lotz, R. Ulber Leibniz Universität Hannover Callinstr. 3 30167 Hanovra Germania 1

Importanța cartofului aprox. 220 de specii de vânat și aproximativ 2000 de specii cunoscute în întreaga lume astăzi recoltează aproximativ 300 milioane de tone anual în 2004 în UE 2,7 milioane ha de suprafață cultivată; Randament 65 milioane t aprox. 30% cartofi cu amidon (25-30 de soiuri diferite) Operațiunea campaniei (cartofi de masă din iunie până în septembrie; cartofi cu amidon din august până în ianuarie) 2

Ingredientele cartofilor cu amidon 11-21% carbohidrați 01% grăsimi 0,1 2% proteine 2% fibre 72% apă aminoacizi, vitamine și minerale apă 72% cartofi aminoacizi 2% amidon 20% proteine 2% alte ingrediente 2% fibre 2% 3

Producție industrială de amidon (amidon Emsland) Cartofi Spălare cartofi Răzătoare Decantor Osmoză inversă Amidon și fibre Debit secundar proteic ridicat Separator (spălarea amidonului) Apă de fructe din cartofi (KFW) Amidon 4

Valoarea adăugată a proteinei din cartof Aprox. 6 milioane de tone de KFW în apă din Europa 94% apă din cartofi, aminoacizi 2% alte componente 2% componente, pur aritmetic h în jur de 120.000 t amidon proteic cartof 0,5% proteine 2% compoziție a proteinelor KFW: 40% patatină (glicoproteină majoră) 50% protează Inhibitori (proteine minore) 10% proteine cu greutate moleculară ridicată (polifenol oxidaze, kinaze, fosforilaze) 5

Glicoproteine patatine formate din 362 aminoacizi (bogate în lizină și tirozină) MW = 40-44 kda, pi = 4.5-5.2 (izoforme cu diferite modele de glicozilare) Activități enzimatice: activitate lipidică transferazică, activitate lipidică acilhidrolazică, activitate esterazică, Osborne și Campbell, J. Am. Chem. Soc. 1986, 18, 575 Jacusen și Foote, J. Food Biochem. 1980, 4, 43 6

Grupul de inhibitori de protează (PI) Clasa eterogenă de proteine bogate în cisteină, stabile la căldură MW = 4-23 kda; pi = 5.1-9.0 90 Joacă un rol în apărarea plantei împotriva dăunătorilor etc. Efect inhibitor asupra serinei și cisteinei proteazei Promovează senzația de sațietate (Proteaza Inhibitor II) Efect anticancerigen posibil 7 Kennedy și colab., Pharmacol. Ther. 1998, 78, 167-209. Pouvreau și colab., J. Agri și Food Chem 2001, 49 (6), 2864 Hill și colab., Physiol și Behav. 1990, 48, 241

Utilizarea fracțiunilor de proteine din cartof Nutraceutice Alimente pentru bebeluși și alimente speciale Nutriție sportivă (Amino Mass) Marketing ca inhibitor al apetitului (Satise) Utilizare medicală Tratamentul diabetului II și al cancerului de piele 8

Nutraceuticals Alimente cu efect fiziologic pozitiv Lupta împotriva bolilor/prevenirii și creșterii performanței/bunăstării Comparativ cu creșterea pieței globale a alimentelor (1-3% pe an), volumul pieței de nutraceutice crește cu aproximativ 8% anual (piața mondială estimată 12 miliarde de euro ) Cerințe: gust bun, fii practic, efect ușor de înțeles, ieftin, arată bine 9

Valoarea adăugată a proteinei din cartof KFW Coagularea termică a proteinelor KFW oferă un produs denaturat Stadiul tehnicii Precipitații proteice 110 C Fără bioactivitate Comercializare ca hrană pentru animale de calitate scăzută Prețul denaturat al proteinei din cartof pe kg ca proteină din cartof Furaj pentru bovine: 0,5 până la 1 aditiv alimentar simplu: 4 până la 6 Procesul de adsorbție cu membrană KFW Vision proteine fracționate de cartof (native) izolarea fracțiunilor de proteine bioactive (native) comercializare ca ingrediente funcționale de înaltă calitate preț de vânzare estimat pe kg: aproximativ 50 10

amestec de proteine (proteinele se leagă în funcție de punctul izoelectric) - -SO - 3 OS- 3 - -SO 3 - OS- 3 - -SO 3 - OS- 3 profil prin porii membranei dimensiunea porilor: aproximativ 3,0 µm grosimea membranei: 180-200 µm modul plat (scopuri analitice) modul spiralat (aval de proteine) flux vertical către suprafața membranei flux vertical către suprafața membranei

Diversitatea liganzilor materialelor din aval (grupe cationice c, 2+ 2+ anticorpi, Ni, Cu) Material de bază (membrană, margele) condiții din aval (de exemplu câmp electric) chimie de legare (aldehidă, epoxidică)

imunoglobuline proteine țintă ligand rt-pa, rh-gh glic. proteine streptavidină His-tag-protein plasmide, protein protein A anticorp concanavalin A biotină Cu, Ni aptamere

Placă montată pe dungi cu 8 godeuri

Încărcare inteligentă a probelor de screening

schimbător de cationi anion schimbător de proteine A His-tag anticorp Con A

adăugarea probei pe membrana de captare

probă schimbător de cationi 6 probă schimbător de anioni 4 proteină A probă 11 probă His-tag 3 probă de anticorpi 10 Con A probă 1

01 0,1 02 0,2 03 0,3 04 0,4 05 0,5 06 0,6 07 0,7 08 0,8 09 0,9 10 1,0 11 1,1 12 1,2 schimbător de cationi probă schimbător de anioni 6 probă 4 proteină A probă 11 probă His-tag 3 probă de anticorpi 10 Con o probă 1 gradient de clorură de sodiu

Adsorbant cu membrană de mărire la scară Scalare simplă diferită Geometrii și moduri de funcționare Module de centrifugare (1,9 7,5 cm 2) Până la 2 mg proteină/cm 2 Module Sartobind (15, 75, 100 cm 2) Până la 0,8 mg proteină/cm 2 24 Modul Sartobind MultiSep-Module (0,1 80 m 2) Până la 0,8 mg proteină/cm 2

Separarea proteinelor folosind adsorbanți cu membrană Utilizarea modulelor de membrană anionică (Q) și a schimbătorului de cationi (S) (Sartobind 15-100 cm 2) Tampon A Tampon B Supapa de injecție a pompei LC Pompa LC Modulul de membrană a probei celulei de amestecare Detector UV colector de fracțiune de conductivitate 25

Rezultate la scară de laborator Fracția Q: Fracția Patatin S: Proteine minore 2,00 1,0 1,75 100 0,9 100 1,50 80 0,8 80 AU [280 nm] 1,25 1,00 0,75 60 40 eluant în% AU [280 nm] 0,7 0,6 0,5 0,4 60 40 eluant în% 0,50 20 0,3 20 0,25 0 0,2 0 0,00 0 5 10 15 20 25 30 35 Timp t în [min] 0,1 0 5 10 15 20 Timp t în [min] Profil de încărcare și eluție a unui modul Q15 Profil de eluție al unui modul S15 26

Rezultate la scară de laborator Etape de proces Echilibrarea modulului de membrană cu 50 mm NaPP (ph 7) Încărcare cu KFW (diluat 1: 5, ph 6,5) Clătire cu 50 mm NaPP (ph 7) Eluare cu soluție 0,5 M NaCl Regenerare membrană cu 1M volum de încărcare a soluției NaCl 0,7 L/m² capacități de legare a zonei membranei S adsorbant: 0,67 mg/cm² Q adsorbant: 0,23 mg/cm²

Separarea proteinelor folosind adsorbant cu membrană SDS-PAGE (Tris-HCL, 18%, colorare Coomassie) Banda 1: Marker de greutate moleculară lk Banda 2: Apă de fructe de cartof diluată 1:10 Banda 3 și 4: Fracția de eluare (0,5 M NaCl, Q 15) Banda 5: Fracția de spălare 6: Fracție de eluție (0,5 M NaCI, S 15) 28

Caracterizarea fracției Q - MALDI-MSMS 29

Caracterizarea fracției S - MALDI-MSMS 4153 7879 7857 Supresor al apetitului: fracțiunea SATISE S inhibitor Kunitz KI Bowman Birk inhibitor BBI carboxipeptidază inhibitor CPI 20305 100 4271 intensitate [%] relativ Int 80 60 40 20 4144 3890 4292 8058 10101 20227 S KI BBI CPI 0 inhibitor al poftei de mâncare 5000 10000 15000 20000 25000 masă (m/z) 30

Mărirea la scară de proces Module Sartobind (15, 75, 100 cm 2) Module Sartobind MultiSep (6600 cm 2) 31

Membrana inovatoare proces aval aval KFW clarificare primară/solide de microfiltrare (proteine, amidon, fibre etc.) adsorbție membrană deproteinizată KFW (Q) - adsorbție membrană 6600cm² (S) membrană adsorbție 6600cm² deproteinizată KFW eluat eluat soluție de sare ultra/diafiltrare ultra/diafiltrare sare soluție retentat Liofilizare retentată/uscare prin pulverizare liofilizare/uscare prin pulverizare inhibitori de patatină protează xx.xx.2007 32

Rezultate la scara procesului etapa de proces V [L] t [min] P [bar] Echilibrare 5 32 3,2 20 2,0 (20 mm NaPP, ph 7) KFW încărcare 10 5,6 2,2 (microfiltrat, 1: 5 diluat, ph 6,5) Clătire (20 mm NaPP, ph 7) 10 4,2 2,2 Modul Elution Q 7,5 3,0 0,8 (0,5 M NaCl) Modul S Elution 6,0 2,3 1,0 (NaCl 0,5 M) regenerarea membranei (NaCl 1 M) 5,0 2,0 0,8 Capacitate de legare a adsorberului S: 1,00 mg/cm² (mic: 0,67 mg/cm 2), Adsorber Q: 0,37 mg/cm² (mic: 0,23 mg/cm 2) 33

Membrana de 1 m 2 este utilizată pentru a obține (legarea și eluția a 80% din proteinele conținute în KFW pot fi realizate în prezent): - 3,7 g patatină - 10 g inhibitori de protează - aceasta durează 20-25 de minute, o creștere a zonei membranei nu duce la o creștere a timpilor. Utilizați KFW 1: 5 diluat 5 L pe 1 m 2 xx.xx.2007 34

Gel și electroforeză capilară Analiza produsului Fracții de spălare Fracții de eluție Au (214 nm) S fracție Q fracție kda 100 85 70 60 50 40 30 KFW Q membrană S membrana 25 20 0 5 10 15 20 25 Timp de migrare [min] Analize ale activității enzimatice 15 M Test (lipid acilhidrolază) pentru patatină Determinarea activității inhibitorului de protează împotriva tripsinei Activitatea polifenol oxidazei testează l ität 35 PI

Componente perturbatoare: Glicoalcaloizii se găsesc în principal în coaja de cartofi și germeni 20-2525 mg/100g produs proaspăt ca prag toxic Simptome: dureri în gât, greață/vărsături, diaree, crampe stomacale și intestinale, cefalee, febră, dificultăți de respirație, amețeli, pierderea cunoștinței D-galactoză N D- Glucoză N HO HO OH L-glucoză O β O OH OH OH O β OO HO α O CH 3 OH OH L-ramnoză α-solanină: MW 868,08 g/mol H 3 C HO HO O L-ramnoză α O HO OH OH OO α HO β OO CH 3 OH OH L-ramnoză α-chaconină: MW 852,08 g/mol 36 Maga; Crit. Rev. Food Sci Nutr 1980; Lee, 12 (4), 371 și colab; J Agric Food Chem.2004; 52 (10), 2832

Analiză glicoalcaloidă HPLC Extracție proteină de cartof (fracție) extracție acid acetic Purificare în fază solidă Analiză HPLC Rezultat 0,15 Solanin standard Chaconin standard Extract de proteină de cartof AU (200 nm m) 0,10 0,05 Chaconin lanin So 000 0,00-0, 05 0 5 10 15 20 25 30 35 Timp de retenție [min] Determinarea cantitativă a glicoalcaloidului până la 20 ppm, fracțiunile obținute prin adsorbanți cu membrană nu conțin alcaloizi ! 37

Concluzie Apa de fructe din cartof conține cantități mari de proteine biologic valoroase. Proteinele au fost obținute până acum denaturate prin coagulare termică (furaje pentru bovine). Prin utilizarea unui proces inovator de membrană, proteinele pot fi fracționate ușor și izolate într-o formă bioactivă. Valoarea adăugată ridicată a unui flux de deșeuri industriale (KFW) un transfer de la scara de laborator la scara industrială este posibilă 38

Producție industrială de amidon și proteine Cartofi Spălare cartofi Răzdătoare Decantor Osmoză inversă Amidon și materiale fibroase Separator KFW (spălare din amidon) Proces inovator de membrană Precipitație proteică 110 C Proteină de cartof fracționată de amidon (nativă) Proteină de cartof denaturată xx.xx.2007 39

Producția de proteine Apă de fructe din cartof Procesul de membrană în aval Fracții de proteine bioactive native Patatină Fracția inhibitorului proteazei Activități enzimatice: activitate lipidică transferază activitate lipidă acilhidrolază activitate esterază MW = 40-44 44 kda, pi = 4,5-5,2 5,2 xx.xx.2007 41 Efect inhibitor asupra serinei și cisteinei proteazei MW = 4-23 kda; pi = 5.1-9.0

Prezentare generală a fracțiunilor proteice Conținut de proteine [%] Masă molară [kda] Patatin ti 38 40 (80) Inhibitor de cartof I (PI-1) 4,5 7,7-7,9 (39) Inhibitor de cartof II (PI-2) 22 10, 2 (21) Inhibitor al proteazei aspartilului cartofului (PAPI) 6 19,9-22 Inhibitor al proteazei cisteinilului cartofului (PCPI) 12 20,1-22,8 Inhibitor al proteazei Kunitz al cartofului (PKPI) 4 20,22 Alți inhibitori de serină protează ) 1,5 21-21,8 Inhibitor al carboxipetidazei cartofilor (PCPI) 1 4,3 Polifenoloxidaze (PPO) fără informații 60; 69 izoenzime fosforilază fără informații 180-600 amidon sinteze fără informații 140 kinaze proteice fără informații lectină 1 65,5 xx.xx.2007 42

Materii prime regenerabile Produse agricole și forestiere produse în sectorul nealimentar (în special pentru producția de bioenergie) Reziduuri agricole Zer (prelucrarea laptelui) Melasă (prelucrarea sfeclei de zahăr) Apă de fructe din cartofi (producția de amidon) Ulber; CIT 2005, 77 nr. 4, 363 xx.xx.2007 43

Amidon de cartofi Producția anuală în UE 9,1 Cartofi de amidon Miot au un conținut de amidon de până la 21% (cartofi de masă aproximativ 15%) Orez aproximativ 70-7575%, grâu 58-64%, porumb 60-70% Amidon este format din 20% amiloză și 80% amilopectină Sursa: Asociația Industriei Amidonului xx.xx.2007 44

Utilizarea amidonului Produse tehnice (hârtie, adezivi, materiale de construcții, textile) Produse cosmetice 50% sunt acum prelucrate în sectorul alimentar xx.xx.2007 46

Grup de inhibitori de protează Proporție de proteine KFW proteină [%] Masă molară [kda] Inhibitor de cartof I (PI-1) 4,5 7,7-7,9 (39) Inhibitor de cartof II (PI-2) 22 10, 2 (21) Inhibitor al proteazei aspartilului cartofului (PAPI) 6 19,9-22 Inhibitor al cisteinil proteazei cartofului (PCPI) 12 20,1-22,8 Inhibitor al proteazei Kunitz al cartofului (PKPI) 4 20,2 Alți inhibitori ai serinei proteazei (OSPI) 15 1,5 21-21,8 Inhibitor al carboxipetidazei cartofilor (PCPI) 1 4,3 47

Calitatea proteinei din cartof Calitate nutritivă ridicată: 120 limitativă: triptofan 100 max. Scor aminoacizi (AAS) 80 pur vegetal 60 proporție ridicată de glutamină sau proteină g] Anfo [mg/g 40 FAO/OMS proteină standard de cartof Amidon Emsland 20 0 Recomandare FAO/OMS (1990): Digestibilitatea proteinelor AAS corectat = AAS x fecal adevărat digestibilitate Ile Leu Lys Met + Cys Tyr Thr Trp Val Proteine Valoare biologică Digestibilitate [%] AAS PDCAAS FAO/WHO/UNU Expert Consultation (1985), Energy and Protein Requirements, Technical Report Series 724. World Health Organization, Geneva Beef 80 98 0,94 0,92 Ou 100 98 100 1,00 100 1,00 Raport Seria 724. World Health Lapte de vacă 91 95 1,00 1,00 Soia 74 95 0,96 0,91 Grâu 64 91 0,47 0,42 Cartof t 69-100 1,00 - Schaafsma, G. (2000), Digestia proteică corectată scor de aminoacizi. Journal of Nutrition 130, 1865-1867 48

Caracterizarea Grupului Q - MALDI MSMS secvența de aminoacizi: 1 MATTKSFLIL FFMILATTSS TCAKLEEMVT VLSIDGGGIK GIIPAIILEF 51 LEGQLQEVDN NKDARLADYF DVIGGTSTGG LLTAMITTPN ENNRPFAAAK 101 DIVPFYFEHG PHIFNYSGSI LGPMYDGKYL LQVLQEKLGE TRVHQALTEV 151 AISSFDIKTN KPVIFTKSNL AKSPELDAKM YDICYSTAAA PIYFPPHHFV 201 THTSNGARYE FNLVDGAVAT VGDPALLSLS VATRLAQEDP AFSSIKSLDY 251 KQMLLLSLGT GTNSEFDKTY TAEEAAKWGP LRWMLAIQQM TNAASSYMTD 301 YYISTVFQAR HSQNNYLRVQ ENALNGTTTE MDDASEANME LLVQVGETLL 351 KKPVSKDSPE TYEEALKRFA KLLSDRKKLR ANKASH Digestia triptică oferă mase peptidice care se potrivesc cu digestia teoretică Identificarea clară a patatinei prin compararea bazei de date xx.xx.2007 49

Caracterizarea fracției S - intensitatea MALDI-MSMS [%] 100 80 60 40 Fracția S 75

4300 Da inhibitor Kunitz (aprox. 20 kda) Inhibitor carboxipeptidază (aprox. 4300 Da) S 75 fracție

20305 Da 20 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 m/z xx.xx.2007 50

schimbător de cationi anion schimbător de proteine A His-tag anticorp Con A

adăugarea probei pe membrana de captare

probă schimbător de cationi 6 probă schimbător de anioni 4 proteină A probă 11 probă His-tag 3 probă de anticorpi 10 Con A probă 1

Placă montată pe dungi cu 8 godeuri

Avantajele tehnologiei cu membrană Performanță și capacitate de separare ridicate Posibile condiții de proces ușoare Transfer de material convectiv, limitare minimă a difuziei Debit ridicat, timp de procesare redus 62