Metode pentru studierea legării ligandului. Dializa de echilibru

Metode pentru investigarea legăturilor ligand Dializă de echilibru Modul cinetic al enzimei: Șef: Prof. Hans Bisswanger Supervizare: Elena Kracker Protocol de testare: Paula Quecke Stefan Mogk Pagina 1 din 15

Imagine de copertă: bloc de dializă Ilustrația este schematică și nu se referă la produsele de pe piață. Blocul prezentat este împărțit în două celule, care sunt fiecare compartimentate de o membrană într-o cameră interioară și exterioară. 1 Index 1.1 Cuprins 1 Index. 2 1.1 Cuprins. 2 1.2 Lista figurilor. 2 2 Introducere. 3 3 Material și metode. 3 3.1 Produse chimice și instrumente. 3 3.2 Test indol. 4 3.3 Dializa de echilibru. 5 4 Partea experimentală. 7 4.1 Calibrarea testului de indol. 7 4.2 Determinarea timpului de dializă. 8 4.3 Efectuarea unei dialize de echilibru. 10 5 Rezumat și discuții. 14 6 Literatură. 15 1.2 Lista figurilor Figura 1: Colorarea indolului cu reactivul Ehrlich. 4 Figura 2: Cum funcționează o dializă de echilibru. 5 Figura 3: Metode de evaluare posibile. 6 Figura 4: Calibrarea testului de indol. 8 Figura 5: Determinarea timpului de dializă. 9 Figura 6: Distribuția indolilor (dispariția) după dializă. 12 Figura 7: Distribuția indolilor (concentrația) după dializă. 12 Figura 8: Evaluare prin aplicarea directă. 13 Figura 9: Evaluare utilizând dublă reprezentare reciprocă. 13 Figura 10: Evaluarea Scatchard. 14 Pagina 2 din 15

Transmisie T = I/I 0 [] (1) Absorbție A = 1-T [] (2) Extincție E = ε * c * d [] (3) E = log 1/T (4) ε: coeficient de extincție c: Concentrația d: grosimea stratului 3.3 Dializa de echilibru O celulă de dializă este împărțită într-o cameră exterioară și o cameră interioară de o membrană semipermeabilă cu o dimensiune a porilor definită: Figura 2: Cum funcționează o dializă de echilibru etichetat radioactiv în funcție de ligand) în concentrații diferite. Membrana este permeabilă doar ligandului cu greutate moleculară mică (limita de excludere a cuvintelor cheie), gradientul de concentrație este compensat prin difuzie. Ligandul legat de macromoleculă este retras din echilibru și înlocuit de ligandii care curg până când porțiunile libere ale ligandului din ambele camere sunt aceleași. În echilibru, se aplică următoarele: [ligand, exterior] = [ligand, interior, liber] (5) [ligand, interior, total] = [interior, liber] + [interior, legat] (6) 5 în 6 [Interior, legat] = [interior, total] [ligand, exterior] (7) pagina 5 din 15

4 Partea experimentală 4.1 Calibrarea testului de indol Pentru a putea calcula concentrația de indol din absorbanța măsurată, a fost făcută o serie de diluție cu cantități cunoscute de indol și testul de indol efectuat așa cum este descris. Concentrațiile în intervalul din jurul constantei de disociere au fost alese în mod deliberat pentru seria de diluare. Tabelul 1: Calibrarea testului de indol Indol 1: 100 KPP (1000 µm) (0,1 M) V [µl] V [µl] c [µm] E [] *) (572 nm) 0 250 0 0,000 5 245 20 0,041 10 240 40 0,082 15 235 60 0,110 20 230 80 0,159 (Kd = 100 µm) 25 225 100 0,207 50 200 200 0,363 Concentrație în intervalul 75 175 300 0,507 1/10 Kd