Nou potențial de vaccinare al rv3131, o nitroreductază putativă codificată cu dosr-regulon, împotriva tulpinei k hipervirulente de Mycobacterium tuberculosis k - Rapoarte științifice - Rapoarte științifice - 2020

subiecte

abstract

introducere

În acest studiu, am examinat imunogenitatea și efectele protectoare ale Rv3131 formulate în GLA-SE (Glucopyranosyl Lipid Adjuvant Stable Emulsion), un adjuvant TLR4 bine definit, ca platformă de vaccin pentru subunități împotriva expunerii hipervirulente la Mtb K.

Rezultate

Transcriptul rv3131 este reglat în faza de creștere exponențială, în starea hipoxică și în macrofage, indiferent de faza de creștere din izolatul de Mtb virulent

38 kDa de Rv3131 au fost confirmate prin electroforeză pe gel de dodecilsulfat de sodiu-poliacrilamidă (SDS-PAGE) și Western blot (1c).

( A ) Nivelul de expresie al rv3131 a fost evaluat folosind qRT-PCR. Diferitele modificări de pliere între Mtb H37Rv (bară gri deschis) și Mtb K (bară gri închis) în diferite condiții de creștere, fază exponențială și condiții de cultură hipoxică au fost determinate folosind metoda ΔΔCt, iar expresia 16 S rRNA a fost utilizată ca control endogen. Rv3133c (dosR) a fost utilizat ca control pozitiv. ( b ) QRT-PCR a fost, de asemenea, utilizat pentru exprimarea rv3131 a Mtb în BMDMs. Diferitele modificări de pliere între Mtb H37Rv (bară gri deschis) și Mtb K (bară gri închis) au fost determinate utilizând metoda ΔΔCt și expresia 16 S rRNA a fost utilizată ca control endogen. Rv3133c (dosR) a fost utilizat ca control pozitiv. ( c ) Coomassie colorat în albastru SDS-PAGE 10% cu proteină Rv3131 recombinantă (panoul din stânga), purificat în condiții fără endotoxine și confirmat prin Western blot cu un anticorp anti-histidină (panoul din dreapta). M: marker standard al greutății moleculare.

Imunogenitate și memorie imunologică indusă de imunizarea Rv3131

Fiecare grup de șoareci a fost imunizat și eutanasiat așa cum este descris în secțiunea Metode. La patru săptămâni după ultima imunizare, șoarecii din fiecare grup au fost sacrificați și celulele pulmonare și splinice au fost tratați cu Rv3131 (5 μg/ml) la 37 ° C timp de 12 ore în prezența Golgi Stop. ( A ) Strategia de gating utilizată pentru identificarea populațiilor de celule T multifuncționale specifice Ag. ( b ) Când sunt stimulați cu vaccinul Rv3131 Ag, procentele de celule T CD4 + CD62L și CD8 + CD62L multifuncționale specifice Ag, care produc TNF- & agr;, IFN- & ggr; și/sau IL-2 care produce în celulele pulmonare și splinice din fiecare grupă imunizată au fost evaluate utilizând citometrie în flux. Frecvențele medii ale celulelor care produc citokine efectoare sunt prezentate ca diagrame. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SD pentru 5 șoareci din fiecare grup. Semnificația diferențelor a fost determinată cu un test t nepereche. O valoare p

În plus, variația genetică extinsă poate duce la modificări ale eficacității vaccinului și la căi de exprimare a genelor care sunt importante pentru dezvoltarea vaccinului TB. De exemplu, Cohen și colab. prezice că o înțelegere incompletă a diversității tulpinilor micobacteriene ar putea avea un impact negativ semnificativ asupra eficacității vaccinului, deoarece vaccinul înlocuiește variantele nevizate ale Mtb cu tulpina 38. În plus, Homolka și colab. a sugerat că diversitatea genetică a tulpinilor Mtb întărește nevoia de a aborda provocarea utilizării diferitelor tulpini Mtb ca etapă comună în testarea vaccinurilor și testarea medicamentelor 39 .

Prin urmare, am emis ipoteza că Ags supraexprimat specific genotipului și tulpinei Mtb clinic predominant ar putea fi Ags țintă bun pentru vaccin. În cele din urmă, prin analiza microarray a transcrierilor genetice, am identificat că Rv3131 îndeplinea standardul de mai sus printre genele codificate cu regulon DosR. Din câte știm, aceasta este prima dată când RV3131 legat de regulamentul DosR este eficient împotriva provocării cu o tulpină de Mtb clinică extrem de virulentă la Beijing.

În acest studiu am investigat dacă Rv3131 a produs un IFN-γ specific Ag în timpul infecției cu Mtb K. -Reacția (2a) și ce tip de răspuns al celulelor T este indus de vaccinarea cu Rv3131 și GLA-SE (2, 3 și 4) 5) înainte și după provocare. Studiul nostru a arătat că Rv3131 a indus un răspuns IF-γ specific Ag în timpul infecției cu Mtb K și că vaccinarea cu Rv3131 și GLA-SE a indus un răspuns puternic al celulelor T cu memorie specifică Ag. În plus, vaccinul împotriva subunității Rv3131 a indus un răspuns de memorie robust și susținut bazat pe Th1 (Figurile 2, 3 și 5) și un efect protector comparabil împotriva Mtb K în contrast cu protecția indusă de BCG ca vaccinare împotriva unei singure subunități Ag 4 Săptămâni după vaccinare. Infecție (Fig. 4).

Recent, Zvi și colab. a raportat că 189 de gene din 3.989 de produse ORF ale genomului Mtb au fost selectate in silico ca vaccinuri supuse candidatilor pe baza unui set de date la scara genomului creat prin extragerea extensivă a datelor și bioinformatica 44. Dintre cei 189 de candidați la vaccin, Rv3131 și Rv3127, o altă nitroreductază codificată cu regulon DosR și a doua cea mai mare genă din studiul nostru de profil de transcripție au fost incluși în lista celor 45 de rezultate de top. În plus față de analiza teoretică, dovezile experimentale indică faptul că Rv3131 este o celulă T Ag. De exemplu, răspunsurile imune ale celulelor T induse de Rv3131, specifice MTb, au fost raportate la subiecții pozitivi cu teste cutanate la tuberculină, dar nu și la pacienții cu controale sănătoase sau la pacienții cu TBC 45. Ca un alt exemplu, Rv3131 a demonstrat cel mai imunogen potențial de Ag comparativ cu celelalte Ag-uri legate de DosR testate pentru capacitatea lor de a induce IFN-γ într-o populație gambiană infectată latent 46 .

Pe scurt, datele noastre prezente indică faptul că Rv3131 codificat cu DosR, un nou Ag țintă pentru dezvoltarea vaccinului TB, are potențial ca un vaccin Ag eficient prin îndeplinirea următoarelor criterii: expresie constitutivă și stabilă în Ptk-Mtb hiper-virulentă; capacitatea de a fi recunoscut de sistemul imunitar în timpul unei infecții in vivo; abilitatea de a induce celule T multifuncționale specifice Ag, cu tendință Th1; și eficacitate împotriva tulpinilor de Mtb hiper-virulente. Prin urmare, Rv3131 poate fi un candidat excelent pentru utilizarea într-un vaccin cu antigeni multipli ai subunităților Mtb, mai ales având în vedere eficacitatea limitată a vaccinului BCG împotriva familiei Beijing.

Metode

Animale

Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare și reglementările Administrației Coreene pentru Alimente și Medicamente (KFDA). Protocoalele experimentale au fost revizuite și aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (numărul permisului: 2015-0041) al Sistemului de sănătate al Universității Yonsei (Seul, Coreea). După aprobarea studiilor, șoareci femele C57BL/6 fără patogeni (SPF) în vârstă de 6 până la 7 săptămâni au fost achiziționate de la Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Japonia) și găzduite într-o unitate BSL-3 la Avison Biomedical Research Centrul de la Colegiul de Medicină Yonsei.

Tulpini bacteriene și producerea de ARN bacterian

Experimente și analize microarray

Diapozitivele oligoarray Mtb au fost furnizate cu amabilitate de Dr. Stefan HE Kaufmann (Institutul Max Planck pentru Biologia Infecției, Berlin, Germania). Marcarea ARN și hibridizarea matricei au fost efectuate așa cum s-a descris anterior 59. Diapozitivele hibridizate au fost scanate cu un scaner de microarray GenePix 4000B (Axon Instruments, CA, SUA) și intensitățile punctelor au fost identificate și cuantificate cu TM4 Microarray Software Suite (//www.tm4.org). Intensitățile semnalului punctului au fost normalizate în MIDAS utilizând opțiunile algoritmului LOWESS și intensitatea câmpului total. Pentru analiza statistică, au fost utilizate patru replici biologice pentru condiții de creștere exponențiale și trei replici biologice pentru condiții de cultură hipoxică.

Generarea de BMDM și infecție in vitro

BMDM-urile au fost generate așa cum s-a descris anterior 61. După 6 zile, BMDM diferențiate au fost infectate cu Mtb H37Rv și K la un MOI de 10 timp de 24 de ore.

Confirmarea expresiei rv3131 prin qRT-PCR

H37Rv Mtb total și ARN-K au fost extrase din faza de creștere exponențială sub hipoxie și BMDM infectate cu Mtb folosind Trizol așa cum s-a descris mai sus. ADNc a fost apoi sintetizat utilizând un mix master RT & GO (MP Biomedicals, Germania) conform recomandărilor furnizorului. După sinteză, expresia diferențială a genei între Mtb H37Rv și K a fost măsurată folosind un qRT-PCR așa cum s-a descris anterior 62. Pe scurt, qRT-PCR a fost efectuat pe un sistem StepOnePlus ™ PCR în timp real (Applied Biosystems, CA, SUA) utilizând SYBR® Premix Ex Taq ™ II (Takara Bio Inc., Shiga, Japonia). qRT-PCR a fost efectuat folosind următoarele seturi de grund; rv3131 înainte, 5'-GTGCCCTAGACCGAATGAAA-3 'și înapoi, 5'-TAGCGCCCACTCCAAATG-3', dosR (rv3133c) înainte, 5'-AGACATCAAGGGAATGGAGTTG-3 'și înapoi, 5'-TGGTCGGGCGGGCGGGGG 3 'și înapoi, 5'-CGGGACTTAACCCAACATCTC-3'. Schimbarea de ori a expresiei genice între Mtb H37Rv și Mtb K a fost calculată utilizând metoda ΔΔCt și s-a utilizat 16 S rARN pentru normalizare. Trei replici biologice au fost utilizate pentru analiza statistică.

Exprimarea și purificarea proteinei Rv3131 recombinante

Imunizarea șoarecilor

Șoarecii C57BL/6 au fost imunizați prin trei injecții intramusculare la trei săptămâni distanță. Fiecare imunizare conținea 5 μg de proteină recombinantă Rv3131 cu 5 μg de GLA-SE (adjuvant lipidic glucopiranozilic) formulat într-o emulsie stabilă ulei-în-apă (SE) de la IDRI (Institutul de Cercetare a Bolilor Infecțioase). GLA-SE a fost furnizat cu amabilitate de către IDRI (Seattle, WA, SUA). Pentru imunizarea BCG, șoarecii au fost injectați subcutanat cu 2 × 105 CFU BCG Pasteur 1173P2. Grupul martor al șoarecilor a fost imunizat numai cu GLA-SE. Celulele splinei și pulmonare au fost colectate și utilizate pentru analiza imunogenității la 4 săptămâni după ultima imunizare.

Infecția cu MTB

La patru săptămâni după ultima imunizare, controlul adjuvant (GLA-SE) și șoarecii vaccinați (BCG, Rv3131/GLA-SE) au fost infectați aerogen cu tulpina Mtb K așa cum este descris mai sus 63. Pe scurt, șoarecii au fost expuși la Mtb K timp de 60 de minute în camera de inhalare a unui dispozitiv de infecție a aerului (Glas-Col, Terre Haute, IN) calibrat pentru a elibera o doză predeterminată. Pentru a confirma încărcarea bacteriană inițială, patru șoareci au fost eutanasiați o zi mai târziu și aproximativ 150 de bacterii viabile au fost eliberate în plămânii fiecărui șoarece.

Măsurarea citokinelor

Celulele unice preparate din splină și plămâni ale șoarecilor infectați cu Mtb sau imunizați au fost stimulate cu Rv3131 (5 μg/ml) sau PPD (2 μg/ml) timp de 24 de ore la 37 ° C. PPD a fost furnizat cu amabilitate de Dr. Brennan la Aeras (Rockville, MD, SUA). Nivelurile de IFN-γ secretat (eBioscience, San Diego, CA), IL-4 și IL-5 (BD Bioscience, San Diego, CA) în supernatantul de cultură au fost detectate folosind un kit ELISA comercial conform instrucțiunilor producătorului.

Titrări de anticorpi în ser

Reacțiile IgG1 și IgG2c specifice Rv3131 din ser au fost evaluate așa cum s-a descris anterior 63. Pe scurt, plăcile cu 96 de godeuri au fost umplute cu 2. g/ml Rv3131 acoperit; Ca anticorp secundar a fost utilizat un anticorp conjugat cu peroxidază de hrean (HRP) împotriva IgG1 (BD Bioscience, San Diego, CA) sau IgG2c (Southern Biotech, Birmingham, AL). Densitățile optice (DO) au fost determinate la 495 nm în 15 minute de la sfârșitul reacției.

Analiza subpopulațiilor de celule T

Suspensiile cu celule unice de celule pulmonare și splenice au fost preparate așa cum s-a descris anterior 65. Suspensiile cu o singură celulă au fost mai întâi blocate cu anti-CD16/32 timp de 15 minute la 4 ° C. După aplicarea suprafeței celulei cu kit Aqua-Dead-Cell-fixabil LIVE/DEAD ™ (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SUA), Brilliant Violet 421 (BV421) -conjugat anti-CD3ε -Peridinină-clorofilă (PerCP) -Cy5,5-anti-CD4 conjugat, aloficocianină (APC) -Cy7-anti-CD8 conjugat (BD Bioscience, San Diego, CA), ficoeritrina (PE) -conjugat anti-CD44, Anticorp anti-CD127 conjugat APC și izotiocianat de fluoresceină (FITC) anticorp conjugat anti-CD62L (eBioscience, San Diego, CA) timp de 30 de minute la 4 ° C, numărând fiecare tip de celulă T de memorie folosind un FACSVerse- Citometre de flux (BD Biosciences) și software disponibile în comerț (FlowJo) analizate.

Colorarea citokinelor intracelulare

Suspensiile cu o singură celulă de șoareci imunizați și infectați (2 × 106 celule) au fost stimulate cu Rv3131 (5 μg/ml) sau PPD (2 μg/ml) la 37 ° C. timp de 12 ore în prezența GolgiStop (BD Bioscience). Celulele au fost mai întâi spălate cu PBS, blocate cu un anticorp anti-CD16/32 de blocare la 4 ° C timp de 15 minute și apoi colorate la suprafață cu anticorpi marcați cu fluorocrom împotriva CD3, CD4, CD8 și CD62L, precum și LIVE/DEAD TM Fixable Aqua Dead Trusa de celule timp de 30 de minute la 4 ° C. Ca martori negativi, celulele au fost colorate la suprafață cu imunoglobulina potrivită cu izotip (Ig). Celulele au fost spălate cu Cytofix/Citoperm (BD Biosciences) timp de 30 de minute la 4 ° C, fixate și permeabilizate. Celulele au fost spălate de două ori cu Perm/Wash (BD Biosciences) și apoi colorate intracelular cu anti-TNF-α conjugat cu APC, anti-IFN-γ conjugat cu PE și anti-IL-2 conjugat cu PE-Cy7 (BD Biosciences) pentru 30 min la 4 ° C. Celulele au fost spălate cu Perm/Wash și apoi fixate cu IC Fixation Buffer (eBioscience). După ce au fost resuspendate în PBS, celulele au fost analizate folosind un citometru de flux.

Enumerare bacteriană și analiză histopatologică

analize statistice

Toate rezultatele in vitro sunt reprezentative pentru cel puțin trei experimente independente cu rezultate consistente. Datele din grafice sunt prezentate ca medie ± deviație standard (SD). Datele din experimentul in vivo sunt raportate ca mediană cu interval intercuartil (IQR). Comparațiile între eșantioane au fost făcute utilizând un test t nepereche sau ANOVA unidirecțional, urmat de testul de comparație multiplă al lui Tukey atunci când datele au fost distribuite în mod normal folosind Prism 5 (GraphPad Software versiunea 5, San Diego, CA).

informatii suplimentare

Cum se citează acest articol: Kwon, KW și colab. Potențial nou de vaccin al Rv3131, o nitroreductază putativă codificată în doson regulon, împotriva tulpinii hipercirulente Mycobacterium tuberculosis K. Sci. reprezentant. Al 7-lea, 44151; doi: 10.1038/srep44151 (2017).

Nota editorului: Springer Nature rămâne neutru în ceea ce privește cererile de jurisdicție din hărțile publicate și conexiunile instituționale.

Informatii suplimentare

Documente Word

Informatii suplimentare

Observații

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord cu termenii noștri de utilizare și cu regulile comunității. Dacă găsiți ceva abuziv sau care nu respectă termenii sau liniile directoare, marcați-l ca fiind inadecvat.