Teză. Trimis pentru a obține o diplomă în biologie la Facultatea de Biologie a Universității Ruhr Bochum

Teză de diplomă Depusă pentru a obține o diplomă în biologie la Facultatea de Biologie a Universității Ruhr Bochum Analiza reziduurilor extractibile și neextractabile ale sulfadiazinei și a metaboliților săi la trei ani de la aplicarea gunoiului de porc la lizimetri și remobilizarea reziduurilor neextractabile prin activitatea rizosferei de porumb. Pregătit de Wibke Schulte-Hunsbeck în Geografie fizică/Știința solului/Ecologia solului de la Facultatea de Geoștiințe Bochum, în septembrie. 2009 Vorbitor: Prof. Dr. Bernd Marschner Co-arbitru: Prof. Dr. Dominik Begerow

Această teză de diplomă a fost creată în colaborare amicală cu Forschungszentrum Jülich GmbH, membru al Asociației Centrelor Germane de Cercetare Helmholtz. Institutul Agrosphere ICG 4 Forschungszentrum Jülich GmbH 52425 Jülich (Clădirea 16.6) Șeful institutului: Prof. Dr. Contact la fața locului Harry Vereecken: Dr. Joost Groeneweg

Declarație Declar prin prezenta că am scris teza depusă astăzi independent și că nu am folosit alte surse și ajutoare decât cele date și că am marcat citații. Această teză de diplomă constă din patru exemplare care sunt complet identice în cuvânt și imagine. De asemenea, declar că imaginile digitale conțin doar datele originale și că nu a fost efectuată nicio prelucrare a imaginii pentru a schimba conținutul. Conducătorul tezei a fost: prof. Dr. Bernd Marschner În calitate de co-arbitri, sugerez: Prof. Dr. Dominik Begerow Bochum, (subtitrare)

Cuprins Cuprins Lista cifrelor Lista tabelelor Lista abrevierilor și simbolurilor 1! Introducere. 13! 1.1! Sulfadiazină. 15! 1.2! Revizuire de literatura. 16! 1.2.1! Transportul substanțelor în sol. 16! 1.2.2! Absorbția în sol. 19! 1.2.3! Reziduuri neextractabile. 24! 1.2.4! Transportați absorbția SDZ în fabrică. 25! 1.2.5! Defalcarea SDZ în sol. 26! 1.2.6! Degradarea SDZ fotochimic. 27! 1.2.7! Degradarea SDZ la mamifere. 28! 1.3! Stabilirea obiectivelor. 30 2! Material si metode. 31! 2.1! Descrierea etajelor de testare. 31! 2.2! Lisimetru. 33! 2.2.1! Testează lizimetrul. 35! 2.2.2! Istoricul și starea inițială a lizimetrelor de testare. 36! 2.3! Caracterizarea substanței testate. 37! 2.4! Metode. 38! 2.4.1! Eșantionarea solului. 38! 2.4.2! Pregătirea probelor de sol. 39! 2,5! Parametrii însoțitori. 40! 2.5.1! determinarea valorii ph. 40! 2.5.2! Determinarea umidității solului. 40! 2.6! Extragerea solului. 41 ! Al 6-lea!

Conținut 2.7! Extragere în fază solidă. 43! 2,8! Proces de plante. 45! 2.8.1! Setare experimentala. 45! 2.8.2! Prelevarea de plante. 47! 2,9! Metode de analiză. 48! 2.9.1! Oxidant. 48! 2.9.2! Măsurarea LSC. 50! 2.9.3! LC-MS/MS. 51! 2.10! Evaluare. 54 3! Rezultate. 56! 3.1! Experimente lisimetrice. 56! 3.1.1! 0,5 m! -Încercări de lizimetru. 56! 3.1.2! 1 m! Lisimetru. 68! 3.2! Proces de plante. 74 4! Discuţie. 83! 4.1! Lisimetru. 83! 4.1.1! Parametrii însoțitori. 83! 4.1.2! Echilibrarea SDZ în lizimetri. 85! 4.1.3! Extracția secvențială și analiza metabolitului. 90! 4.1.4! Sorbția SDZ. 94! 4.2! Proces de plante. 97! 4.2.1! Parametrii însoțitori. 97! 4.2.2! Remobilizarea SDZ sechestrată prin activitate rizosferă. 98! 4.3! Rezumat. 100 5! Bibliografie. 101! 6! Anexa A. 106 ! Al 7-lea!

Cuprins Tab. 20: Concentrație echivalentă (c eq) de SDZ [mmol g -1] a extracției secvențiale din probe de sol din testul de lizimetru și testul de plantare A2 (Kal) și B2 (Mer). 81! Tab. 21: Concentrația SDZ și a metaboliților săi [mmol g -1] de aceto. + Extracția H2O în probe de sol din experimentul de lisimetru și experimentul de plantare A2 (Kal) și B2 (Mer). 82! Tab. 22: Cantitate echivalentă (A eq) de SDZ [mmol] din extracția secvențială din probele de sol prin lizimetrul A1 (Kal) până la o adâncime de 30 cm în ziua de prelevare 29, 120, 218, 1022. 106! Tab. 23: Cantitate echivalentă (A eq) de SDZ [mmol] din extracția secvențială din probele de sol cu lizimetrul B1 (Mer) până la o adâncime de 30 cm în ziua de prelevare 29, 120, 218, 1022. 107 ! 11!

Cuprins Lista abrevierilor și simbolurilor Abrevierea 4-OH-SDZ 4-Hydroxysulfadiazine Activitate APG per gram de sol [Bq g -1] A echivalentă cantitate [mmol] Aceto. Acety-SDZ BBA c eq Acetonitril N-Acetil-Sulphadiazine Liniile directoare pentru testarea produselor de protecție a plantelor și a echipamentelor de protecție a plantelor Concentrație echivalentă [mmol g-1] ADN Acid dezoxiribonucleic FZJ Forschungszentrum Jülich GLP Bună practică de laborator HPLC High Performance Liquid Chromatography ICG K/B Vase Kick/Brauckmann k OC LC-MS/MS LSC Mer MRSA MS NER PKs Coeficient de absorbție (n = prietenos pentru carbon organic) cromatografie lichidă cuplată cu spectrometrie de masă tandem Contor de scintilare lichid Merzenhausen multirezistent Staphylococcus aureus tulpini Spectrometru de masă Reziduuri neextractabile logaritm decadic negativ al constantei de acid K s! Densitate [g cm - "] SDZ Sulfadiazină SOP Instrucțiuni de operare standard SPE Extragere în fază solidă Organizația Mondială a Sănătății OMS Wk max Capacitate maximă de reținere a apei [%]! 12!

Introducere Transportul SDZ în sol Studiile de transport cu SDZ au arătat că rezultate diferite duc la aplicarea SDZ cu apă sau cu gunoi de grajd lichid. Dacă SDZ se aplică împreună cu gunoi de grajd lichid, investigațiile Burkhardt și colab. (2005), Kay și colab. (2005) și Blackwell și colab. (2007) care suspensia favorizează scurgerea de suprafață a SDZ. Investigațiile au arătat că gunoiul de grajd lichid, datorită conținutului său solid, închide porii fini ai solului și astfel SDZ se scurge mai repede decât alte antibiotice (Burkhardt și colab., 2005). Tipul de sol este irelevant aici; scurgerea rapidă a suprafeței a fost observată atât în solurile argiloase (Blackwell și colab., 2007), cât și în solurile nisipoase (Kay și colab., 2005). Când SDZ este aplicat cu gunoi de grajd lichid, SDZ pătrunde în sol prin fluxul preferențial, așa cum s-a demonstrat în studiile Burkhardt (2007). 18!

Mai degrabă inițiați concentrarea. Cu cât este mai mare proporția unui ion în soluția solului, cu atât este mai mare proporția sa în acoperirea ionică (Schroeder și Blum, 1992). Complexul sferic interior al SDZ se bazează pe formarea de compuși complecși și asigură absorbția specifică. Molecula sau ionul soluției solului acționează ca un ligand și deplasează un ligand coordonat în jurul atomului central al ionului metalic. Datorită formării legăturilor covalente între liganzi, acești complexe sferice interioare sunt foarte stabile (Scheffer și Schachtschabel, 2002). Fig. 3: Absorbția cationilor pe o suprafață minerală de oxid sau argilă cu o sarcină variabilă (Sigg & Stumm 1994 Aquati Chemistry, Teubner, Stuttgart).! 21!

Introducerea dioxidului de carbon trebuie exclusă. Doar o cotă de 2% din suma totală dată a fost estimată la 14 CO 2. Acest lucru arată că SDZ poate fi descompus doar foarte lent în sol. În investigațiile curente, s-au putut face declarații despre produsele de degradare, astfel 4-OH-SDZ, formil-SDZ și 4- (2-minopirimidinil-1 (2H)) anilină au fost identificate (inter alia: Sukul și colab., 2008). 1.2.6 Degradarea fotochimică a SDZ Degradarea SDZ de către lumina soarelui (radiații UV) este un mecanism de degradare pur abiotic. Degradarea fotolitică a fost, printre altele, de Sukul și colab. (2008) și Wollters și Steffens (2005). Dacă SDZ se aplică cu suspensie, este expus la radiații UV mai mult timp. Această cale de descompunere pentru SDZ este posibilă doar într-o măsură limitată în soluri. Degradarea fotochimică depinde puternic de valoarea ph și deci de componentele din jur. În cazul degradării fotochimice, domină fotoliza indirectă (Wolters și Steffens, 2005). Componentele excitate de cantele ușoare pot transmite această stimulare către SDZ și astfel o pot stimula să se descompună. Substanțele fotosensibile pot duce la o creștere a fotodegradării, de exemplu peroxidul de hidrogen, acizii humici, acizii fulvici și acetonă (Sukul și colab. 2008).! 27!

Introducere 1.2.7 Degradarea SDZ la mamifere În timpul biotransformării SDZ la porci, 96% din SDZ-ul marcat cu 14 C administrat este excretat. Aceasta înseamnă că doar 4% este ingerat de animal. Biotransformarea SDZ la porci a fost descrisă de Lamshöft și colab. (2007) examinate în detaliu. SDZ marcat radioactiv (14 C-SDZ) a fost hrănit la porci timp de patru zile și excrețiile lor (gunoi de grajd) au fost colectate zilnic pe o perioadă de 10 zile după administrare. Probele de suspensie colectate au fost analizate pentru SDZ și metaboliții săi. 44% din SDZ a fost excretat alături de principalii metaboliți. Principalii metaboliți găsiți au fost acetil-SDZ (21%) și 4-OH-SDZ (26%). Alți metaboliți secundari au fost N-formil-sulfadiazina (0,1%) și N-acetil-4-sulfadiazina (1,8%). Excreția maximă a avut loc în a șasea zi după administrare. În distribuția activității în gunoi de grajd, 80% s-au găsit în materia solidă și 20% în faza lichidă. Figura 7 prezintă produsele degradării SDZ la porci. Fig. 7: Degradarea 14 C-SDZ prin biotransformare, (* = locația marcajului 14 C) (Lamshöft și colab., 2007).! 28!

Introducere Defalcarea are loc în general la mamifere în două faze. În prima fază, enzime precum Monooxigenaza și reductaza împart grupurile funcționale sau, ca și în cazul hidrolazei, grupurile funcționale sunt atașate (-OH). În a doua fază, metabolitul rezultat este cuplat cu o substanță endogenă, solubilă în apă. Acest lucru crește solubilitatea în apă a substanței care urmează să fie degradată și, prin urmare, poate fi excretată mai ușor. SDZ este eliminat în principal prin rinichi și numai într-o mică măsură prin ficat și intestine (Sukul și Spiteller; 2006). SDZ este complet transformat înapoi în formă SDZ în gunoi de grajd din metaboliți (Langhammer, 1989). Tab. 3: Caracterizarea celor doi metaboliți principali 4-OH-SDZ și acetil-SDZ 4-hidroxisulfadiazină N-acetil-sulfadiazină (4-OH-SDZ) (acetil-SDZ) forma C 10 H 11 N 4 O 3 SC 12 H 14 N 4 O 4 S greutate molară 267,27g/mol 310,32g/mol! 29!

Material și metode Kaldenkirchen (Kal) Braunerde N: 51 18 25 O: 6 12 12 Merzenhausen (Mer) Parabraunerde N: 50 55 50 O: 6 17 47 Fig. 8: Prezentare generală a locațiilor de teren: Merzenhausen (Mer) și Kaldenkirchen (Kal) în NRW.! 32!

Material și metode Fig. 9: Desen schematic al sistemului de lizimetru exterior al ICG-4 cu un monolit încastrat, unghiular de 1 m! Etaj (Pütz, 1993).! 34!

Material și metode 2.3 Caracterizarea substanței testate Gunoiul lichid utilizat pentru acest experiment din experimentele de hrănire, așa cum este descris de Lamshöft și colab. (2007) Secțiunea 1.2.7. 14 C-SDZ utilizat cu puritate de 99% a avut o activitate specifică de 8,6 MBq mg -1 și a fost produs de Bayer AG, Wuppertal. SDZ a fost marcat radioactiv pe atomul 2C al inelului de anilină (14 C-SDZ), vezi Figura 11. SDZ marcat cu 14 C a fost amestecat cu SDZ neetichetat într-un raport de 1:20 (g/g). SDZ nemarcat a fost furnizat de Fluka, Seelze. SDZ marcat radioactiv (14 C-SDZ) a fost alimentat la doi porci. În paralel, SDZ neetichetat a fost administrat oral la alți doi porci în decurs de 4 zile. Animalele care au primit 14 C-SDZ au primit o doză totală de 540 mg d -1 (928,8 MBq). Aceasta corespunde la 30 mg kg -1 d -1 greutate corporală. Animalele care au primit SDZ neetichetat au primit o doză totală de 570 mg kg -1 d -1 greutate corporală. Probele de gunoi de grajd lichid colectate zilnic pe o perioadă de 10 zile au fost analizate folosind detecția de 14 C. Fig. 11: sulfadiazină marcată cu 14 C (14 C-SDZ) (* = locația marcajului 14 C) (Lamshöft și colab. 2007) 37

Material și metode 2.4.2 Pregătirea probelor de sol Pentru următoarele analize, solul a fost cernut la 2 mm și transferat în pungi de PE. Valoarea pH-ului și umiditatea solului au fost apoi determinate în solul umed de câmp. Pentru analize suplimentare, solul a fost uscat la 105 ° C până la greutate constantă. Apoi, aproximativ 200 g au fost omogenizați cu o moară planetară (Retsch PM4) (15 minute la 250 rpm; Förster și colab., 2009). În cazul morii planetare, forța centrifugă apasă materialul de sol (proba de sol) cu bilele de măcinare (cinci bucăți) de peretele bolului de măcinare și astfel îl zdrobește prin frecare. O reprezentare schematică a etapelor de lucru poate fi văzută în Figura 12. Sol proaspăt pe câmp pe 2 mm șapte parametri însoțitori (valoarea ph, umiditatea solului) -secarea -omogenizarea -extracția solului -Oxidant -Analiza LSC -LC-MS/MS Fig. 12: Diagrama fluxului etapelor de lucru ale prelucrării probei de sol.! 39!

Material și metode 2.5 Parametri însoțitori 2.5.1 Determinarea valorii pH-ului Valoarea ph este determinată pe baza DIN ISO 10390. Valoarea ph este determinată într-o suspensie de sol și soluție de clorură de calciu (0,01 M) după o oră de expunere, amestecând ocazional cu un pH-metru. PH-metrul este calibrat cu soluțiile tampon standard ph 4 și ph 7 înainte de utilizare (Blume și colab. 2000). Condiții de analiză Au fost efectuate trei repetări per strat de sol. pH-metru: Mettler Toledo 1120X Cântărire: 10 g sol uscat la aer Reactiv: 25 ml 0,01 M soluție de clorură de calciu 2.5.2 Determinarea umidității solului Umiditatea solului este unul dintre cei mai simpli parametri pentru descrierea condițiilor de apă ale solului. Umiditatea solului nu este măsurată direct, ci indirect, adică gravimetric, prin ocolirea greutății. Solul proaspăt și umed este cântărit și uscat până la greutate constantă. Determinarea umidității solului se efectuează pe baza DIN ISO 11465 (1996-12). Umiditatea solului este dată în raport cu masa umedă a solului în% în masă. Condiții de analiză Au fost efectuate trei repetări per strat de sol. Cântar uscat: Mettler Toledo HB43-S Greutate halogenă: 0,3 g-2 g sol! 40!

Material și metode Tab. 6: Proces schematic de extracție secvențială conform Förster și colab. (2009). Cântărire în: 10 g sol în tuburi de centrifugare Extracție CaCl 2 Extracție Me-OH Extracție Aceto.-Extracție H 2 O -Reactiv: 25 ml, soluție 0,01 M CaCl 2 -24 h agitare deasupra capului -centrifugare * -decantare -cântărire Măsurați supernatantul -1 ml în LSC (scintilator: 10 ml Ultima Gold) -reagent: 25 ml, metanol -4 h agitare deasupra capului -centrifugare * -decantare-cântăriți măsurarea supernatantului -2 ml în LSC (scintilator: 10 ml Instagel) -Digestie cu microunde -Reagent: 50 ml 1: 4 (v: v) acetonitril: apă! Se iau 20 ml din suspensia sol-solvent -Centrifugare ** -decantare -cântărirea măsurii supernatantului -1 ml în LSC (scintilator: 10 ml Instagel)! Extract rămas - centrifugare * - decantare - cântărirea supernatantului - aruncarea supernatantului Uscați fundul în sticla centrifugă pentru incinerarea ulterioară în oxidant *: Allegra 6KR, 30 min la 900 * g **: J2-21 HS, 30 min la 40.000 * g! 42!

Material și metode Tab. 7: Etape de lucru pentru purificarea extractelor de CaCl 2 folosind SPE. Etapa Volum reactiv 1 3 ml metanol 2 3 ml 5:95 metanol: apă distilată 3 3 ml apă distilată Apă 4 X * CaCl 2 extract 5 20 ml dist. Apă 6 Uscați cartușul 15min 7 3 ml de metanol Acidificat la pH2 *: Extractul de CaCI2 a fost combinat înainte de a fi aplicat pe coloană, 1 ml a fost îndepărtat și măsurat în LSC. Restul a fost cântărit și centrifugat (30 min la 40.000 * g; J2-21HS). Supernatantul a fost aplicat pe coloană. Condiții de analiză Coloana SPE: Oasis HLB 6 cc-200 mg (Waters Oasis) Pompa de vid: Vacumbrand Accesoriu SPE: SPE-24G Acid pentru acidificare: 200 µl acid formic! 44!

Material și metode Fig. 13: Configurarea experimentală a experimentului de plantare, (vedere: plante de porumb în vase Kick/Brauckmann sub banca de cultivare a plantelor) Material Vase Kick/Brauckmann: 16 bucăți (Ø = 22 cm) Îngrășământ complet: aproximativ 3 g bob albastru (ENTEC, COMPO) Miez de porumb: 12 buc. PR39K13 (Early Star, Baiano) Scală: Mettler Toledo G5002-2 Cântar uscat: Mettler Toledo HB43-S Halogen Altele: folie de aluminiu, cană de măsurare, lopată de mână, regulă de pliere! 46!

Material și metode 2.8.2 Eșantionarea plantelor Experimentul a fost încheiat după aproximativ 80 de zile. S-au notat greutatea totală a setului de testare, greutatea vaselor Kick/Brauckmann, suprafețele (tulpini și frunze) și părțile subterane ale plantelor și greutatea solului. Rizosfera a fost expusă aproximativ aproximativ prin zdrobirea firimiturilor solului cu degetele. Solul a fost separat de rădăcinile mici și fine rămase prin cernere (