Centrul Medical Universitar Hamburg - Eppendorf

University Medical Center Hamburg - Eppendorf Center for Experimental Medicine Institute for Molecular Cell Biology Director: Prof. Dr. rer. Fiziol. Dr. H. c. Ulrike Beisiegel Despre mecanismul hepatomegaliei în bolile de supraîncărcare a fierului. Investigația expresiei genice la un model de animal de șobolan Disertație pentru obținerea gradului de DOCTOR MEDICINAE al facultății de medicină a Universității din Hamburg Hamburg - Eppendorf prezentat de: Ehsan Khaljani născut. în Teheran/Iran Hamburg 2010

Acceptat de facultatea de medicină la: 25.10.2010 Publicat cu aprobarea facultății de medicină a Universității din Hamburg Supraveghere științifică: PD Dr. Dr. Peter Nielsen Comitetul de audit, președintele: Prof. Dr. Dr. Comisia de examinare Ulrieke Beisiegel: Recenzorul 2: PD Dr. Dr. Comisia de examinare Peter Nielsen: al 3-lea Recenzor: Prof. Dr. R. Böger - 1 -

Cuprins 1. Introducere Metabolismul fierului 5 Semnificația medicală a fierului 12 Ficatul: funcția și fiziologia 16 Mărirea ficatului 17 Descrierea modelului animal și semnificația grupei de grăsime 18 Principiul supraîncărcării fierului cu TMH Ferrozen 19 Histologie 20 Modificări ale expresiei genice la modelul animal de șobolan 20 Întrebarea 27 2. Experimente (material și metode) Examinarea sonografică a volumului ficatului 28 Determinarea concentrației de fier hepatic in vivo cu SQUID 29 Evaluarea statistică a datelor pacientului 30 Model animal de șobolan cu TMH ferozen 32 Îndepărtarea ficatului 33 Determinarea concentrației de fier a ficatului șobolan in vitro 34 Prelucrarea histologică a ficatului șobolanului 35 Izolarea ADN-ului, proteinelor și ARN pentru rt rt PCR 36 Electroforeză pe gel de ARN 38 Transcrierea ARN-ului în cdna 40 Generarea și ordonarea primerilor 41 Realizarea rt rt PCR 44 Evaluarea statistică a datelor rt rt PCR 45 Electroforeză pe gel ADN 49 Efectuarea Western blots cu p-act 5 0-3 -

3. Rezultate Evaluarea statistică a datelor pacientului 51 Volumul ficatului de șobolan 53 Determinarea concentrației de fier în ficat de șobolan in vitro 54 Prelucrarea histologică a ficatului de șobolan 55 Greutăți hepatice de șobolan 56 Evaluarea rt rt PCR și rezultatele Western blots 57 Electroforeză pe gel ADN 68 4. Discuție Discuție despre datele pacientului 69 Discuție despre Histologie 70 Discuția datelor rt rt PCR și Western blots 71 Concluzie 77 5. Rezumat 80 6. Lista abrevierilor 82 7. Surse și referințe 83 8. Anexă (suplimente) curbe rt rt PCR 88 Electroforeză pe gel ADN 88 Fișier general de alimentare 92 9. Mulțumiri 93 10. CV 94 11. Afidavit 96-4 -

Fig.2 Fierul intră în corp în două moduri. Fie prin HCP1 sub formă de hem, fie sub formă de fier redus de plante prin DMT1. Cu ajutorul hemoxigenazei, fierul este eliberat de hem. Conform lui Donovan și colab. (Fiziologia 21: 115-123,2006) Aici este convertit în forma sa trivalentă de Hephaestin, o ferooxidază care conține cupru, în scopul schimbării solubilității sale și, în cele din urmă, legată de transferrin, adusă la destinație (11). Fig.3: Poziția Hefestinului pe peretele bazolateral al enterocitelor. Aici fierul este transformat în forma sa trivalentă și legat de transferină. Mutația feroportinei în hemocromatoza dominantă autozomală: pierderea funcției, câștig în înțelegere, Fleming și colab. (2001) - 7 -

Același lucru este valabil și pentru receptorul transferinei. Fig.6 Proteinele de reglare a fierului se leagă de capătul 3 al ARNm al receptorului transferinei la structura caracteristică a buclei stem și astfel asigură o defalcare redusă a ARNm (degradare mică). Conform Sanchez și colab (2006) Prin acest mecanism, fierul este încorporat în grupul de fier-sulf al IRP1 (IRP1 se desprinde de IRE), astfel încât absorbția fierului este redusă datorită expresiei reduse a DMT1 și ciclul descris mai sus poate începe din nou . Reglarea prezentată poate avea loc, totuși, și la capătul 5 netradus al mrna, unde se poate observa un efect opus, adică o restricție în traducere (21,22). Fig.7 IRP-urile se leagă de capătul 5 al ARNm-ului feritinei și astfel împiedică translația ARNm. Conform lui Sanchez și colab. (2006) - 10 -

Între timp, sunt cunoscute multe gene care prezintă motive IRE, care pot fi chiar identificate cu succes biocomputațional, fără matrice. Biocomputațional înseamnă înregistrarea motivelor cu un software special de căutare pe computer bazat pe secvențele de mrna cunoscute în PubMed. Fig. 8 Reprezentarea genelor purtătoare de IRE care au fost identificate biocomputaționale. Reglarea fierului și ciclul celular, M Sanchez și colab., J Biol Chem. 2006 11 august; 281 (32): 22865-74. Epub 2006 7 iunie După ce fierul absorbit a fost transportat în celula țintă de transferină, fierul este stocat în feritină sub formă de oxid polimeric de fier-hidroxid-fosfat. Fig.9 Această imagine a feritinei produsă prin cristalografie cu raze X arată depozitarea fierului mineral în centrul miezului feritinei (maro). Potrivit lui Casidy și colab. 2004 Ferritina este capabilă să elibereze fier din depozite sau să continue să depoziteze fier, în funcție de nevoile organismului. - 11 -

Fig.11: Principiul peroxidării lipidelor și consecințele acesteia Potrivit lui Nielsen și colab (2006), sunt cunoscute multe alte imagini clinice în legătură cu supraîncărcarea cu fier, deși severitatea simptomelor depinde de variația genetică respectivă. Miocardiocitele stochează fierul, ceea ce duce la fibroza miocardică toxică. În cursul hemocromatozei, în pancreas poate apărea fibroză pancreatică cu insuficiență pluriglandulară, care poate duce la diabet zaharat secundar. Aceasta se mai numește și diabet de bronz datorită suprapigmentării pielii existente. Sideroza plasmatică poate fi adesea diagnosticată în măduva osoasă, care se caracterizează printr-o depunere brută intralizozomală de fier în apropierea nucleului (28). Depozitele de fier sunt detectabile în toate cazurile prin culoarea clasică de albastru prusac. Hemocromatoza complexă a bolii este împărțită în patru subformații. Simptomele și severitatea variază ca putere. Hemocromatoza de tip 1 este cea mai frecventă sub-formă din lumea occidentală (29) și este, de asemenea, subiectul studiilor la pacienți în această teză de doctorat. - 14 -

Fier hepatic (mg/g greutate hepatică) 35 30 25 20 15 10 5 0 Concentrație hepatică a fierului cu TMH-Ferrozen-H Hocromatoză 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 timp de hrănire în săptămâni Fig. 14 Figura prezintă evoluția stocării fierului în ficat în mg/g greutate hepatică în raport cu durata hrănirii. Odată cu creșterea timpului de hrănire, se ajunge la un platou în cantitatea de fier din ficat. Nielsen 2006 1.7. Histologie Investigațiile anterioare nu au reușit încă să clarifice dacă ficatul mărit de supraîncărcarea cu fier la șobolani a fost hipertrofiat sau a crescut în volum din cauza proliferării. Nici inflamația nu a fost încă exclusă. 1.8. Modificări ale expresiei genice la modelul animal de șobolan Pe baza presupunerii că supraîncărcarea cu fier și grăsime ar duce la variații în expresia genei, a fost investigată transcrierea markerilor reprezentativi pentru căile metabolice în cauză (Fig. 15), care va fi discutată mai detaliat mai jos. Fig.15 Ficatul în centrul diferitelor procese metabolice - 20 -

Fig. 17 IGF-1 ca parte a axei ficat-os hipofiză hipotalamică. IGF-1 este influențat direct de hormonul de creștere și este un mediator al hipertrofiei. Sursa: http://www.mfi.ku.dk Proteinele purtătoare (IGF-BP 1-6 = factorul de creștere al insulinei - proteina de legare) sunt legate de plasmă după ce IGF-1 a fost secretat și sunt, de asemenea, sub hormon de creștere. și controlul insulinei. Acești hormoni determină când IGF1 se poate desprinde de proteinele sale de legare, trece la forma activă și se leagă în cele din urmă de receptorul său (IGF-R = receptor de factor de creștere asemănător insulinei). Cu structura sa tetramerică și activitatea intracelulară a tirozin kinazei, IGF-R seamănă cu receptorul de insulină și permite IGF-1 să inițieze cascade de semnal intracelular. Rezultatul secvenței semnal este apoi biosinteza proteică crescută, o inhibare a proteolizei, încorporarea timidinelor în ADN și încorporarea sulfaților în proteoglicanii (24). Influența markerilor de hipertrofie a fost urmată și la nivelul proteinelor. Fosforilarea AKT-1 a fost luată în considerare cu Western blots. - 24 -

Fig. 18 IGF-1 și calea de semnalizare AKT sunt direct legate în căile anti-apoptotice. Sursă: www.biocarta.com, modificat din Khaljani 2008 AKT-1 este o protein kinază pentru diferite căi de semnal în cascadă (cum ar fi apoptoza, procesele ciclului celular, anigiogeneza), dar AKT-1 este direct legată de IGF-1. Astfel, AKT-1 mediază efectul anti-apoptotic al IGF-1 prin creșterea acestuia. Hipertrofia fără AKT-1 crescut poate fi în mare parte exclusă, deoarece este, de asemenea, un mediator central în căile de hipertrofie. Diferenți factori care influențează fierul asupra ACT trebuie încă luați în considerare, deoarece fierul ca agent nociv intervine în diferite căi metabolice. Gene de inflamație Creșterea excesivă a celulelor poate avea alte cauze decât proliferarea și hipertrofia. În acest context, o extindere a ficatului este posibilă în cursul unui proces inflamator, pe care am dorit să îl observăm prin examinarea markerilor de inflamație. Markerul proinflamator citat clasic în literatură este TNF-a (factor de necroză tumorală-a), pe care, prin urmare, l-am selectat și pentru studiul nostru. - 25 -

1.9. Întrebare Următoarele întrebări ar trebui să aibă răspuns în acest studiu: 1. Supraîncărcarea cu fier duce la hepatomegalie la om, la fel ca la șobolani? 2. Este posibilă mărirea ficatului la pacienți direct dependentă de concentrația de fier în ficat? 3. Ce gene joacă un rol în mărirea ficatului indusă de fier la șobolani: proliferare, hipertrofie sau inflamație și ce arată histologia? 4. Supraîncărcările de fier și grăsimi provoacă reacții similare la nivelul expresiei genelor și la nivelul proteinelor? - 27 -

2. Experimente (material și metode) 2.1. Examinarea volumului hepatic sonografic Material: - Dispozitiv cu ultrasunete: Picker CS 9500 - Gel de contact cu ultrasunete: Caesar și Loritz - Saltea sub vid: Vac Fix As - Canapea mobilă Pentru a determina volumul ficatului, pacienții se așează pe spate, astfel încât ficatul sub arcada costală să poată fi accesat cu ușurință câştig. După aceasta, imaginile cu ultrasunete au fost realizate în plan sagital cu ajutorul capului cu ultrasunete sub control laser la o distanță de 2 cm. Zona ficatului trebuia marcată manual pe imagini și înmulțită cu grosimea feliei de 2 cm. După adunarea rezultatelor celor 8 imagini secționale, volumul ficatului a fost aproximativ. Lucrarea a fost realizată cu sprijinul amabil al dlui Rainer Engelhardt și Roland Fischer de la clinica de metabolism a fierului din Centrul pentru Medicină pentru Femei și Copii, Clinică și Policlinică f. Hematologie și oncologie pediatrică, Spitalul Universitar Eppendorf. Fig. 19 Extras din fișa pacientului. Se notează numărul de identificare (ID), sexul (sexul), mutația hemocromatozei (C282Y, H63D), diagnosticul, greutatea, dimensiunea, precum și volumul hepatic măsurat (Vol-liv) și concentrația de fier hepatic (LIC) - 28 -

Gs a (subunitate alfa a unei proteine G stimulante) a fost, de asemenea, măsurată inițial, care a arătat date comparabile. Cu toate acestea, GAPDH s-a dovedit a fi mai fiabil în lucrările practice, astfel încât expresia genelor țintă a fost legată de GAPDH. 3.7. Electroforeza gelului ADN Imaginile gelurilor ADN pot fi găsite în anexă. Imaginile sunt folosite pentru a verifica rt PCR pentru subproduse nedorite și contaminare. Gelul ADN poate fi, de asemenea, utilizat pentru a determina dacă produsul așteptat are dimensiunea adecvată, care ar putea fi verificată folosind scara de 100 bp din partea stângă a imaginii. Prima bandă inferioară a scării reprezintă 100 bp, a doua pentru 200 bp etc. Deoarece s-au folosit numai grunduri care au prezentat produse PCR curate în gel în timpul testului, doar o singură bandă clară poate fi văzută în toate imaginile de gel la nivelul respectiv. Cantitatea depinde de mărimea ADN-ului amplificat, care este notată în lista primerului. Controlul PCR arată dimensiunea corectă a produsului PCR în toate imaginile și este negativ pentru contaminare. - 68 -