Dezvoltarea glomerulară ca test ex vivo pentru analiza căilor implicate în activarea celulelor epiteliale parietale

rezumat

Acest articol descrie o metodă pentru cultivarea și analiza excrescenței celulelor epiteliale parietale glomerulare din glomeruli încapsulați, izolați din rinichiul șoarecelui. Această metodă poate fi utilizată pentru a studia căile implicate în proliferarea și migrarea celulelor epiteliale parietale.

Abstract

Introducere

Bolile glomerulare reprezintă un grup important de afecțiuni renale și sunt o cauză principală a bolii renale în stadiul final (ESRD). Din păcate, opțiunile specifice de tratament sunt limitate, iar tranziția la ESRD este inevitabilă. Bolile glomerulare sunt definite de prezența leziunilor glomerulare și pot fi grupate în boli inflamatorii și neinflamatorii. Deși insulta inițială este diferită, studii recente au arătat că un mecanism celular comun duce la hiperplazie de celule epiteliale glomerulare și în cele din urmă la glomeruloscleroză în toate bolile glomerulare, indiferent de cauza de bază 1, 2, 3, 4 .

În special, s-a demonstrat că leziunile glomerulosclerotice constau în principal din celule epiteliale parietale activate 5, 6. În condiții fiziologice, celulele epiteliale parietale sunt celule epiteliale plate, latente, care acoperă capsula glomerulului Bowman. Cu toate acestea, orice leziune glomerulară, fie datorată mutațiilor genetice (de exemplu, citopatii specifice podocitelor sau mitocondriale), inflamației sau hiperfiltrării (de exemplu, cauzată de scăderea masei renale, hipertensiunii arteriale, obezității sau diabetului zaharat) poate declanșa activarea celulelor epiteliale parietale . Celulele epiteliale parietale activate se înmulțesc și depun matrice extracelulară, ceea ce duce la formarea călugărilor semilunari celulari sau a leziunilor sclerotice 5, 7, 8. Progresia acestor procese duce la pierderea funcției renale 9. Prin urmare, activarea activării celulelor epiteliale parietale este un factor cheie în dezvoltarea și progresia glomerulosclerozei în bolile glomerulare inflamatorii și neinflamatorii 1, 2, 3, 4, 10 .

Procesele moleculare care mediază activarea celulelor epiteliale parietale sunt încă în mare parte necunoscute. Studii recente arată că celulele epiteliale parietale activate de novo EXPRESS CD44, un receptor care este implicat în activarea diferitelor căi în proliferarea și migrația celulară. În plus, s-a demonstrat că inhibarea CD44 inhibă activarea activării celulelor epiteliale parietale și atenuează progresia formării semilunii și a glomerulosclerozei la modelele animale de boli glomerulare inflamatorii și neinflamatorii 11, 12.

Deoarece activarea celulelor epiteliale parietale este un actor important în dezvoltarea glomerulosclerozei și formarea semilunelor, inhibarea acestor celule ar putea încetini progresia bolilor glomerulare. Elucidarea căilor moleculare care determină activarea celulelor epiteliale parietale poate duce la dezvoltarea unor intervenții terapeutice specifice care atenuează formarea leziunilor hiperplazice și glomeruloclerotice în bolile glomerulare.

În modelele animale experimentale, este adesea dificil să se furnizeze dovezi ale unui efect direct al expresiei genei modificate (modele knock-out sau modele transgenice de șoarece) sau de tratament medicamentos asupra celulelor epiteliale parietale. La un șoarece convențional, modificările in vivo observate pot fi explicate prin modificări directe ale celulelor epiteliale parietale. Cu toate acestea, deoarece expresia genelor este modificată și în alte tipuri de celule din șoarece, efectele indirecte care sunt mediate de alte tipuri de celule nu pot fi excluse. Dezvoltarea șoarecilor condiționați Cre-Lox conduși de promotori care sunt activi în primul rând în celulele epiteliale parietale a oferit o soluție pentru 13 în unele cazuri. Cu toate acestea, modelele transgenice condiționate sunt complexe și, în timp ce mai multe linii condiționale devin disponibile, multe dintre liniile tradiționale knock-out sau transgenice de șoarece nu sunt încă înlocuite condiționat.

Pentru a studia efectele directe asupra celulelor epiteliale parietale, grupul nostru a dezvoltat un test ex vivo folosind glomeruli încapsulați singuri, izolați din rinichii șoarecilor, pentru a măsura și analiza proliferarea și migrația celulelor epiteliale parietale. Această metodă ne va permite să determinăm efectele specifice celulelor epiteliale parietale și să găsim căi responsabile pentru activarea celulelor epiteliale parietale și să testăm opțiunile de tratament pentru a inhiba această activare.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Toate experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare ale Comitetului de etică a animalelor de la Universitatea Radboud Nijmegen.

NOTĂ: Șoareci de tip sălbatic netratați și sănătoși (n = 4) și șoareci cd44 -/- (n = 4) au fost sacrificați la vârsta de 12 până la 16 săptămâni. Au fost folosiți atât șoareci masculi, cât și femele. Toți șoarecii erau pe fundalul C57Bl/6.

Sacrificați șoareci WT sănătoși sau șoareci modificați genetic prin dislocare cervicală.
Disecați rinichi întregi de șoarece imediat după sacrificarea șoarecilor. Pentru a face acest lucru, faceți o laparotomie mediană cu foarfece abdominale, tăiați pielea și apoi mușchii abdominali. Scoateți intestinul și așezați-l lângă mouse.
Eliberați rinichii de îmbinarea țesuturilor și scoateți rinichiul cu clești chirurgicali, tăiați cu foarfeca artera renală, vena renală și ureterul.
Îndepărtați capsulele renale din rinichi ținând rinichiul cu o pensă chirurgicală și îndepărtați capsula cu o altă pereche de pensă.
Pregătiți rinichii într-o placă de cultură celulară cu 6 godeuri (2 rinichi/godeu) cu 2 ml soluție de sare echilibrată Von Hanks (HBSS) per godeu și puneți-o pe gheață.

2. Izolarea glomerulilor din rinichi de șoarece

3. Cultivarea excrescenței glomerulare

4. Analiza proliferării celulelor epiteliale parietale

5. Caracterizarea creșterii celulelor glomerulare

NOTĂ: Pentru a evalua compoziția celulară a excrescenței, colorarea imunofluorescentă pentru markeri specifici celulei se efectuează pe excrescențele glomerulare la t = 6 zile.

Îndepărtați cu grijă mediul și spălați ușor glomerulii de două ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS).
Se fixează timp de 10 min la temperatura camerei cu 2% (greutate/volum) paraformaldehidă (PFA) suplimentată cu 4% (greutate/volum) zaharoză în PBS și se spală cu atenție 2x cu PBS.
Cu anticorpul primar la concentrația adecvată (Tabel de materiale) Incubați în albumina serică PBS-ovină (BSA) diluată 1% (v/v) timp de 1 oră la temperatura camerei.
Îndepărtați soluția de anticorp și spălați cu atenție de 3 ori cu PBS.
Incubați cu anticorp secundar (Tabel de materiale) diluat în PBS-BSA 1% (v/v) în întuneric timp de 45 de minute la temperatura camerei.
Spălați cu atenție de 3 ori cu PBS și asamblați cu 1-2 picături de mediu de asamblare apos cu 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) pentru a vizualiza nucleele și a acoperi fântâna cu un capac rotund.
Faceți fotografii microscopice cu un microscop cu fluorescență.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

Figura 1: Prezentare schematică a metodei pentru efectuarea unui test de creștere glomerulară pentru a analiza proliferarea celulelor epiteliale. (1) Rinichii sunt disecați de la șoareci sacrificați și tocați în bucăți mici. (2) Țesutul renal este forțat prin sita de 300 m și clătit prin sitele de 75 m și 53 m. (3) Glomerulii rămași pe site sunt colectați cu FCS mediu + 20% (v/v) și transferați pe o placă de montare ultra-mică. (4) Glomerulii individuali sunt colectați cu un microscop cu lumină inversată și transferați pe plăci de cultură cu 24 de godeuri. (5) După incubare la 37 ° C, 5% (v/v) CO2 timp de 6 zile, creșterea glomerulară poate fi analizată cu un microscop digital cu lumină inversată. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

Figura 2: Dezvoltarea glomerulară a glomerulilor încapsulați izolați din rinichi disecați de șoareci WT. Creșterea glomerulilor încapsulați incubați la 37 ° C este indicată în momente diferite: (A.) 0 zile, (B.) 2 zile, (C.) 4 zile și (D.) 6 zile. Glomerulii decapitulați au fost, de asemenea, izolați și cultivați la 37 ° C, iar imaginile microscopice au fost preluateZi0 și (F.) Ziua 6, care nu a arătat celule în creștere. Bara de scalare: (A, E, F) 200 m, (B.) 400 m, (CD) 1000 m Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

Figura 3: Celulele glomerulare în creștere arată expresia markerului de celule epiteliale parietale. Colorarea imunofluorescentă a fost efectuată în a 6-a zi după izolarea glomerulilor individuali încapsulați pentru a caracteriza celulele epiteliale crescute. Celulele în creștere au colorat pozitiv pentru markerii celulelor epiteliale parietale: (A.) CD44, (B.) SSeCKS și (C.) claudin-1, dar nu a arătat nicio expresie a (D.) markerul specific podocitului sinaptopodină sau (E.) markerul specific CD31 al celulei endoteliale, care a fost localizat exclusiv în glomerul. Bara de scalare: (A, B, D, E) 100 m, (C.) 50 'm. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

Figura 4: Creșterea glomerulară este afectată la glomeruli izolați de la șoareci knockout CD44. Glomerulii încapsulați au fost obținuți din rinichi disecați din (A.) Șoareci WT și (B.) cd44 -/- șoareci izolați. Imaginile microscopice au fost realizate cu un microscop digital cu lumină inversată după 6 zile în cultură. Numărul de celule epiteliale parietale în creștere și suprafața excrescenței au fost crescute în glomerulii șoarecilor WT comparativ cu șoarecii cd44 -/-, indicând un rol important pentru CD44 în activarea celulelor epiteliale parietale. Bara de scalare: 1000 m. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

Figura 5: Un exemplu de analiză a suprafeței creșterii glomerulare ca marker pentru proliferarea celulelor epiteliale parietale cu ImageJ (FIJI). (A.) Rezultatul glomerular al unui glomerul încapsulat al unui șoarece WT după 6 zile în cultură la 37 ° C. (B.) Mai întâi se determină scala pentru a analiza suprafața în mm 2. Aici: 1 mm = 460 pixeli. (C.) După setarea scalei, se trasează o linie de selecție în jurul zonei de creștere glomerulară. (D.) Această zonă selectată poate fi apoi măsurată (suprafața din acest exemplu = 2.235 mm 2). Bară de scară: 1000 m. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei imagini.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Folosind protocolul descris în acest articol, se pot utiliza glomeruli individuali încapsulați pentru a evalua proliferarea celulelor epiteliale parietale care este o consecință a activării celulelor epiteliale parietale. Acest model ex vivo ne va permite să studiem în detaliu căile moleculare implicate în activarea celulelor epiteliale parietale. Metoda descrisă se bazează pe conceptul simplu de disecție și cernere a rinichilor pentru a izola și cultiva glomeruli încapsulați și pentru a compara proliferarea și/sau migrarea celulelor epiteliale parietale în diferite condiții experimentale. Rezultatele care pot fi analizate după 6 zile în cultură sunt, de exemplu, suprafața sau diametrul excrescenței sau numărul de celule care cresc dintr-un singur glomerul capsulat. O altă aplicație pentru acest test ar putea fi studierea efectelor medicamentelor care induc sau inhibă căile moleculare care pot fi implicate în activarea celulelor epiteliale parietale.

Colorarea imunofluorescentă a confirmat că celulele care cresc în creștere sunt celule epiteliale parietale după 6 zile în cultură, deoarece au fost colorate pozitive pentru markerii celulelor epiteliale parietale (CD44, claudin-1, SSeCKS), dar nu au exprimat nici markerul specific podocitului sinaptopodină, nici markerul de celule endoteliale CD31. În concordanță cu rezultatele colorării, nu au fost observate celule în creștere la 6 zile după izolarea și cultura glomerulilor decapsulați individuali, sugerând că există o contaminare limitată a altor celule glomerulare în creștere în această perioadă de 6 zile. Un alt studiu a analizat, de asemenea, creșterea glomerulară și a arătat că celulele cu creștere rapidă derivate din creșterea glomerulară au fost, de fapt, derivate din celulele epiteliale parietale 14.

Protocolul de colorare utilizat pentru a analiza expresia markerului a celulelor care depășesc poate fi, de asemenea, adaptat la alte molecule de interes. Imunostainmentul a fost efectuat în godeurile plăcilor în care glomerulii au fost incubați timp de 6 zile. Aceste godeuri nu au fost acoperite în timpul primei incubări de 2-3 ore, dar glomeruli au fost atașați la godeuri. Incubarea pe inserții de sticlă sau un sistem de cameră glisantă, care ar duce la o imagine mai bună, nu a fost posibilă, deoarece glomerulii nu au fost atașați complet la suprafață și creșterea glomerulară a fost afectată. Acest protocol specific a fost stabilit recent pentru a studia creșterea celulelor epiteliale parietale de la glomeruli de la șoareci WT sănătoși și cd44 -/- 11. Cu această metodă s-a arătat că celulele epiteliale parietale deficid CD44 au o rată redusă de proliferare, care este prezentată și în Figura 4va fi aratat. Această metodă poate fi utilizată și pentru șoareci din alte tulpini și, de asemenea, pentru alți șoareci modificați genetic. De exemplu, un studiu anterior a folosit o abordare similară pentru a analiza efectele semnalizării receptorilor glucocorticoizi 15.

Utilizarea acestei tehnici pentru a izola glomerulii de la șoareci și a analiza creșterile celulare are multe avantaje față de utilizarea liniilor celulare epiteliale parietale perpetuate pentru analiza căilor implicate în activarea celulelor epiteliale parietale sau a medicamentelor care împiedică procesul de Ar putea afecta proliferarea celulelor epiteliale. În primul rând, această metodă folosește celule primare care cresc direct din glomerul și sunt în cultură doar 6 zile. Prin urmare, celulele epiteliale parietale din creșterile glomerulare au experimentat mai puține modificări ale fenotipului decât liniile celulare perpetue, care necesită pasaje de creștere suplimentare pentru a produce linia celulară 16. În plus, metoda descrisă aici poate fi utilizată pentru a compara efectul knockout-urilor genetice specifice asupra proliferării celulelor parietale și pentru căile care sunt greu de redus la tăcere în liniile celulare din cauza creșterii celulare afectate sau a eficienței GenKnockout folosind metode de reducere a zgomotului.

Pentru a adapta protocolul la alte modele animale sau la țesutul renal uman, dimensiunea sitelor ar trebui optimizată pentru cel mai bun rezultat. Acest lucru se datorează faptului că dimensiunea glomerulară diferă între specii și, prin urmare, dimensiunea sitei pe care pot fi colectați glomerulii variază. De asemenea, este important să se izoleze glomeruli încapsulați intacti în scopul acestei metode. Prin urmare, glomerulii nu trebuie stoarse, ci clătite ușor prin sitele mai mici.

Un alt pas important al protocolului este colectarea glomerulilor încapsulați după cernere. Aici este important să utilizați mediu cu 20% FCS pentru a evita atașarea glomerulilor unul de celălalt. În plus, soluția îmbogățită cu glomeruli ar trebui să fie transferată direct pe plăci adezive ultra-mici, altfel glomerulii vor fi atașați direct la suprafața plăcilor obișnuite de cultură celulară și chiar la suprafața tuburilor de plastic, ceea ce face dificilă detectarea și izolarea glomerulilor individuali.

După colectarea glomerulilor individuali încapsulați, aceștia ar trebui cultivați timp de 3 ore într-un volum mic al mediului de cultură din centrul puțului pentru a permite aderența. Glomerulii nu trebuie să plutească în direcția liniei de bord a puțurilor pentru a optimiza citirea în timpul analizei imaginii.

Pentru a obține cele mai bune rezultate cu protocolul descris aici, vă recomandăm să cultivați glomeruli individuali și să efectuați citirea în ziua 6. În acest moment, se poate observa o creștere celulară omogenă constând din celule epiteliale parietale. Mai târziu, creșterea glomerulară devine eterogenă fenotipic, sugerând creșterea altor tipuri de celule. Prin urmare, protocolul nu pare a fi potrivit pentru perioade foarte lungi de incubație. Trebuie remarcat faptul că timpii de incubație pentru creșterea celulelor epiteliale parietale pot varia între specii sau între diferite tulpini de șoarece. Prin urmare, timpii de cultură ar trebui să fie testați și optimizați pentru fiecare tulpină sau specie de șoarece. În plus, originea creșterii glomerulare ar trebui întotdeauna validată prin colorare pentru markeri specifici celulelor epiteliale parietale.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.