Diferențierea celulară

Principiul detecției colorimetrice cu p-nitrofenol Metabolizarea pNPP în p-nitrofenol galben de către fosfatazele alcaline legate de membrană ale celulelor vii.

Testul fosfatului de p-nitrofenol (testul pNPP) a fost utilizat pentru prima dată de Engvall și colab. (1980) și este utilizat pentru a determina gradul de diferențiere între celulele aderente și celele neaderente. pNPP este un substrat de fosfatază alcalină (AP). După hidroliza reziduurilor de fosfat de către fosfatază, p-nitrofenolul se formează ca un produs final galben, solubil. După terminarea reacției prin adăugarea unei soluții de hidroxid de sodiu, intensitatea colorării poate fi determinată colorimetric în cititorul ELISA la o lungime de undă de 405 nm. Formarea produsului galben este proporțională cu activitatea fosfatazei alcaline.

Imagine din stânga sus.

Principiul detecției fluorometrice cu difosfat de fluoresceină (FDP)

Ca măsură pentru evaluarea gradului de diferențiere, activitatea fosfatazei alcaline poate fi determinată și fluorimetric.
În acest caz, se utilizează difosfatul fluorescenic de colorant fluorimetric în locul colorantului colorimetric p-NPP. Fosfataza alcalină este capabilă să elibereze fluoresceină din acest compus, care poate fi apoi măsurată fluorimetric (Ex 485nm/Em 538nm) în cititorul cu mai multe plăci.

Evaluarea procesului

1. Determinarea conținutului de proteine din probă utilizând testul Bradford
2. Măsurați absorbanța sau fluorescența probelor
3. Calculul ca µM p-NP sau fluoresceină/min/mg proteină

Figura de deasupra.

Costuri (dovadă colorimetrică)

Costuri (dovadă fluorometrică)

Exemple de aplicații

Studii privind reglarea evenimentelor de diferențiere în contextul homeostaziei celulare și tisulare după suplimentarea flavonoidelor sau oligozaharidelor (Kuntz et al. 2007 și 1999)