Metagenom al clorofilei profunde mediteraneene maxime, examinat prin pirozecvențiere cu bibliotecă directă și fosmidă 454

subiecte

abstract

introducere

Rezultate

Caracteristicile generale ale secvenței generate de ambele abordări

Ambele 454 de plăci de pirosecvențiere au furnizat aproape 1 milion de citiri. Lungimea medie a citirilor a fost mai scurtă în setul de date DS (260 bp) decât în placa fosmid colectată (358 bp). Cu toate acestea, aproape un sfert din datele de secvență obținute de la fosmide au corespuns vectorului, astfel încât cantitatea de date de secvență de mediu din ambele seturi de date a fost similară (aprox. 312 Mbp pentru DS și 325 Mbp pentru fosmide). Figura 1 arată curba de distribuție GC% a proceselor individuale de citire din seturile de date împreună cu un set de date GOS care conținea secvențe dintr-un interval de dimensiuni al filtrului similar (0,1-3 μm) ca al nostru (GS001b și GS001c). Setul de date DS arată clar un vârf la aproximativ 34% GC și este foarte similar cu distribuția eșantionului GOS. Pe de altă parte, citirile DCM fosmid au avut două vârfuri de înălțime similară la 35% și 52%. De fapt, atât în diagramele DS, cât și în cele ale GOS, există o ușoară umăr față de valoarea vârfului GC ridicat al fosmidului. Prin urmare, ADN-ul cu acest conținut de GC este prezent și în ambele seturi de date, dar pare să fie îmbogățit în fosmide. Diagramele GC cu două vârfuri similare au fost descrise și pentru bibliotecile BAC (Feingersch și Béjà, 2009) și pot reflecta părtinirea clonării.

Distribuție GC% a secvențelor generate. Albastru: Toate citirile provin din înregistrarea DS (Direct Sequencing). verde: toate rezultatele obținute prin secvențierea fosmidelor după îndepărtarea secvenței vectoriale; roșu: citește din proba GOS Sargasso Sea Hydrostation S (0, 1-0, 8 și 0, 8-3, 0 μm combinate); Bare portocalii: citiri de la fosmide care au cel puțin o lovitură în setul de date DS (Direct Sequencing). Linii negre: citiri de la fosmide care nu au o lovitură în setul de date DS (Secvențiere directă).

Structura comunității

Citiri individuale

( A ) Clasificarea citirilor DCM-DS folosind bazele de date RDP (16S) și LSU (23S). ( b, c ) Comparația celor două seturi de date, pirozecvența directă (DS) și secvențierea fosmidelor, utilizând BLASTN a citirilor față de baza de date nucleotidică NT + 1000, proiectarea genomului microbian, clasificat utilizând MEGAN. De la stânga la dreapta: clasificarea la nivel de regat, clasificarea citirilor bacteriene și clasificarea citirilor proteobacteriene.

1% din citirile proteobacteriene). Profilul filogenetic pentru setul de date DS a fost, de asemenea, examinat folosind baza de date subsistem SEED disponibilă prin intermediul serverului MG-RAST (Meyer și colab., 2008). Rezultatele obținute au fost similare (Figura suplimentară S1) cu cele descrise mai sus. O prezentare taxonomică a secvențelor care sunt comune ambelor seturi de date poate fi găsită în tabelul suplimentar T3.

Secvențe compuse

Cantitatea de secvență care ar putea fi reunită din ambele seturi de date este descrisă în tabelul suplimentar 1. Din piroza secvențierea DS, doar cinci contigs au fost mai mari de 3 kb (cel mai mare a fost de 4,4 kb). Două dintre ele aparțineau în mod clar lui P. marinus subsp. Pastoris. Similitudinea și sinteza au fost atât de mari încât fragmentele ar putea fi atribuite la nivelul tulpinii (> 98% identitate nucleotidică). Alte contiguri compozite conțineau gene similare genelor cianofage, în special fagii Prochlorococcus PSSM2 și fagii Synechococcus S-PM2 și syn9, deși cu mult mai puține similitudini. Toate sunt miovirusuri de genom mare. PSSM2 a fost izolat din P. marinus NATL1A adaptat la lumină slabă, S-PM2 din Synechococcus WH7803 și syn9 din Synechococcus WH8012, dar este, de asemenea, cunoscut că infectează Prochlorococcus (Sullivan și colab., 2006).

Așa cum era de așteptat, Fosmide a livrat multe contigs mari cu un total de 8,8 MB, care au fost compilate în 1287 contigs cu mai mult de 3 kB (comparativ cu doar 18 kB compilate din DS). Cu toate acestea, au existat doar 55 contigs din setul de date fosmid peste 20 kb, care a fost dimensiunea așteptată a insertului fosmid. Acest lucru sugerează că numărul de fosmide utilizate a fost prea mare pentru a obține o acoperire adecvată și echilibrată pentru cei mai mulți. Cu toate acestea, dimensiunea mare a contigurilor fosmidice este avantajoasă, de exemplu, pentru identificarea microbilor, deoarece un consens poate fi derivat din mai multe gene. Am reușit să atribuim aproape toate secvențele compuse de fosmid> 10 kb cu certitudine, deoarece secvențele mai mici produc deseori atribuții contradictorii sau nesigure. De acum ne limităm la cele 197 de secvențe de fosmid compilate> 10 kb.

(Sus) Fosmida arhaeală cu gena geranilgeranilgliceril fosfat sintază și genele proteorodopsinei (MedDCM-OCT-S08-C16). Toate genele nemarcate sunt ipotetice. (Jos) Arborele filogenetic al tuturor rodopsinelor identificate în setul de date DCM DS.

Unele fosmide pot fi atribuite în mod clar anumitor bacterii, de exemplu bacteria Ellin514 (3 fosmide), γ-proteobacterium marin HTCC2207 (1 fosmid), Opitutus terrae (Verrumicrobium, 1 fosmid), Blastopirellula marina DSM 3645 (1 fosmid), γ marin - Proteobacterium HTCC2143 (1 fosmid) și altele (33 fosmids în total). Candidatus Pelagibacter a primit în mod clar un singur fosmid care, conform analizei ARNr 16S a DS, ar trebui să fie de departe cea mai comună bacterie. Aceasta arată din nou clonarea slabă a fragmentelor de genom din acest microb (Temperton și colab., 2009).

În cele din urmă, un număr de fosmide cu foarte puțină asemănare ar putea fi atribuite celulelor eucariote (24), dintre care unele conțineau gene care erau în mod constant legate de diatomea Thalassiosira pseudonana CCMP1335 și de alga verde Ostreococcus lucimarinus CCE9901, care eucariotele au confirmat din nou prezența acestei fotosinteze. în fracțiunea de 5–0,2 μm (pentru adnotarea detaliată a secvențelor compuse de fosmide a se vedea fișierul suplimentar F2).

Recrutarea genomului individual

Recrutarea DS citește pentru genomuri complete. Inserțiile arată diagramele de recrutare a celor mai mari genomi de recrutare a P. marinus subsp. Pastoris MED4 și Candidatus Pelagibacter sp. HTCC7211. Liniile din curbele de recrutare indică gradul de 96% identitate nucleotidică.

În plus față de genomii microbieni, am recrutat și secvențele DCM-DS împotriva tuturor genomilor disponibili ai fagilor marini. Numărul maxim de citiri a fost în mod clar recrutat de cianofagi care au infectat Prochlorococcus și Synechococcus (vezi Tabelul suplimentar T4), în timp ce alți genomi ai fagilor, de exemplu din fagii Roseobacter sau fagii Vibrio, nu au recrutat nicio lectură.

Fiziologie și ecologie

Am comparat seturile noastre de date cu stațiile GOS, care acoperă o gamă largă de locații geografice și ecologice, deși toate eșantioanele provin din apropierea suprafeței (Rusch și colab., 2007).

Eșantionul GOS GS122a, colectat în Oceanul Indian între Africa de Sud și Madagascar, a fost cel mai similar cu eșantionul nostru (Figura 5). Următoarele două eșantioane provin din Marea Sargasso. Temperatura suprafeței în acest moment (20 ° C) a corespuns cu temperatura medie a suprafeței din zona mediteraneană. Deși nu avem date specifice, putem presupune că locația din Africa de Sud are și un DCM sezonier, în timp ce majoritatea probelor GOS provin din apele tropicale sau din apele reci bogate în nutrienți de pe coasta de est a Americii de Nord. În acest caz, această asemănare ar putea fi explicată prin natura sezonieră a DCM în aceste locații. Deoarece eșantionul a fost prelevat în iarna australiană (septembrie), stratificarea ar fi fost probabil pierdută, iar locuitorii DCM ar fi aproape de suprafață.

Comparația citirilor DCM-DS cu seturile de date GOS Open Ocean (identitate minimă 95%, lungime 25 bp). Sunt afișate primele 10 exemple. Latitudinea, longitudinea, concentrația clorofilei, temperatura și data prelevării sunt afișate deasupra barei pentru fiecare probă.

Conținutul diferit de gene găsite cu GS122a poate fi în mare parte datat de la genele de menaj arhaeale (termosomi arhaeale, flagel arhaeal) (a se vedea fișierul suplimentar F1), care se datorează prezenței arhaeale crescute în DCM din Mediterana. În plus, comparația DCM cu probele de suprafață GOS (inclusiv probele lacului Sargasso) a arătat, de asemenea, prezența arheică crescută în DCM comparativ cu suprafața.

Interesant este că genele implicate în transportul și reglarea fosfatului s-au numărat printre genele care au fost suprareprezentate în DCM în comparație cu suprafața. Acestea includ proteina de legare a fosfatului periplasmic pstC și alți membri ai regulonului de absorbție a fosfatului (PhoB, pstA, pstB). Marea Mediterană este cunoscută pentru faptul că este limitată de fosfat și are un raport mai mare de azot anorganic față de fosfat (Krom și colab., 1991).

Pentru a analiza dacă acest lucru reflectă efectiv deficitul de fosfați, am comparat setul nostru de date cu mai multe seturi de date metagenomice sargazice (cu conținut scăzut de fosfat), precum și cu mai multe probe GOS bogate în nutrienți (Golful Maine, Golful Fundy). Eșantioanele Sargasso GOS nu au prezentat diferențe în prezența genelor legate de absorbția fosfatului, dar eșantioanele bogate în nutrienți au prezentat o diferență semnificativă, similară comparației dintre GS122a și DCM (Fișa suplimentară F1). Nu am găsit diferențe în genele pentru utilizarea fosfonatului, după cum arată studiile anterioare din estul Mediteranei (Feingersch și colab., 2010).

O caracteristică tipică a genomului microbilor din zona afotică este lipsa genelor UVR, care sunt implicate în repararea ADN-ului prin fotoreactivare. Nu am găsit nicio diferență între numărul de gene UVR din suprafață și DCM. Cu toate acestea, unul dintre cele mai supra-reprezentate subsisteme din probele de suprafață GOS în comparație cu DCM a fost familia de proteine de stres universale. Aceasta este o familie veche, larg distribuită și conservată de proteine despre care se știe că este exprimată sub diferite tipuri de stres fiziologic, cum ar fi stresul termic, deficiențele nutriționale și deteriorarea ADN-ului (Kvint și colab., 2003). Reprezentările semnificativ mai slabe ale acestor gene în comunitatea DCM arată că, în ciuda evenimentelor de amestecare anuale, locuitorii lor trăiesc într-un mediu mai constant, care este mai puțin afectat de fluctuațiile de mediu decât la suprafață.

discuţie

Sfatul editorului

Cancer de sân in situ și microchimerism

Subiecte, cancer de sân, epidemiologie a cancerului, prevenirea cancerului Imunoeditare Rezumat Celulele microchimere de origine fetală care rămân în circulația maternă postpartum sunt asociate cu protecția împotriva cancerului de sân invaziv. Aici, folosind metode genomice cantitative, a fost examinată prezența microchimerismului fetal masculin în celulele de straturi de la femei cu antecedente de cancer mamar in situ (CSI) și în controale sănătoase. Fi

Reglarea negativă a autofagiei

Subiecte Autofagie, semnalizare celulară Homeostazie Rezumat Autofagia este un proces catabolic conservat în mod evolutiv în care componentele citoplasmatice sunt infaginate și descompuse printr-o cale autofagosomiosozomală. Autofagia acționează ca un control al calității mediului celular și este implicată într-o mare varietate de condiții patologice. A

Promovarea reparării ADN-ului prin fosforilarea nucleară IKKβ a ATM ca răspuns la stimulii genotoxici

Probleme, cancer, deteriorarea ADN-ului și reparații Rezumat Ataxia-telangiectasia mutată (ATM) este una dintre moleculele cheie implicate în răspunsul celular la deteriorarea ADN-ului. O parte din ATM activat este exportat din nucleul celular în citoplasmă, unde activează calea de semnalizare a kinazei I kappa B/factorului nuclear kappa B (IKK/NF-κB). Aceasta

Ecranul de fosforilare H2AX al celulelor de la pacienții cu cancer sensibil la radiații arată un nou fenotip celular al ADN-ului cu dublă catenă

Subiecte, cancer ADN bicatenar rupe Markeri genetici, radioterapie Acest articol a fost actualizat Rezumat Context: Aproximativ 1-5% dintre pacienții cu cancer suferă reacții semnificative ale țesuturilor normale la radioterapie (RT). În prezent este imposibil să se prevadă modul în care țesuturile normale ale majorității pacienților vor răspunde la RT. D.

Hiperbilirubinemia indusă de Pazopanib este asociată cu polimorfismul UGT1A1 al sindromului Gilbert

Subiecte, Variație genetică, Tulburări metabolice Farmacocinetică, Carcinom cu celule renale Rezumat Context: Pazopanib a demonstrat eficacitate clinică împotriva mai multor tipuri de tumori și este, în general, bine tolerat. Cu toate acestea, s-au observat creșteri izolate ale transaminazelor și ale bilirubinei. D.

Agentul de contrast IRM gadoteridol crește distribuția rAAV1 în hipocampul șobolanului

Subiecți, livrarea genelor Hipocampus Vectori virali Rezumat Agenții de contrast sunt frecvent utilizați în combinație cu imagistica prin rezonanță magnetică (RMN) pentru a monitoriza distribuția moleculelor în creier. Experimente recente efectuate în laboratorul nostru au arătat că co-infuzia serotipului recombinant al virusului adeno-asociat 5 (rAAV5) și a agentului de contrast IRM gadoteridol (Gd) mărește transducția vectorului în striatul șobolanului.