Utilizarea administrării PAMP intratraheale orofaringiene și spălării bronhoalveolare pentru a evalua răspunsul imun la șoareci

rezumat

Răspunsul imun al gazdei la infecția cu agenți patogeni este un proces bine reglementat. Cu ajutorul unui model de expunere pulmonară lipopolizaharidică la șoareci, este posibil să se facă evaluări de înaltă rezoluție ale mecanismelor complexe asociate cu dezvoltarea bolii.

Abstract

Introducere

Protocoalele descrise sunt foarte flexibile și pot fi ușor modificate pentru a evalua o gamă largă de PAMP-uri și daunele asociate modelelor moleculare (atenuate). În plus, cu câteva modificări suplimentare, aceste protocoale pot fi aplicate și studiilor care arată progresia bolii respiratorii alergice sau interacțiunile gazdă-agent patogen cu bacterii vii, viruși sau ciuperci 5-10.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Toate cercetările au fost realizate sub aprobarea Comitetului instituțional de îngrijire și utilizare (IACUC) pentru Virginia Tech și în conformitate cu Ghidul Institutelor Naționale de Sănătate pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator.

1. Inocularea intratraheală (e) a LPS cu administrare orofaringiană

2. Colectarea serului și spălării bronhoalveolare (BAL)

900 μl în trahee, umflând plămânii și retragând imediat HBSS. Așezați BALFUL din spate într-un tub conic de 15 ml.

Repetați această spălare de încă 2 ori pentru a colecta aproximativ 3 ml de BALF pentru analize viitoare. Păstrați BALF pe gheață sau la 4 ° C până la utilizare.

3. Pregătirea histopatologiei

Centrifugați sângele întreg colectat în etapa 2.5 la 12.000 xg timp de 5 minute pentru a izola serul. Serul într-un tub de microcentrifugă pre-etichetat de 1,5 ml și se păstrează la -80 ° C
Evaluați nivelurile serice de citokine prin ELISA sau un test similar. Se diluează serul de la 1,05 la 1,20 într-un tampon de diluție adecvat, în funcție de test, conform instrucțiunilor producătorului. Aceste diluții trebuie determinate empiric înainte de a prelua majoritatea probelor.
Datorită volumului mic de ser obținut, reduceți volumul probei pe placa ELISA cu jumătate încărcată. De exemplu, majoritatea ELISA-urilor comerciale utilizează 100 µl volume de standarde și probe. Pentru a economisi probe, încărcați 50 μl de standarde și ser diluat pe godeu.
Centrifugați BALF într-o centrifugă frigorifică de la bancă la 200 g timp de 5 minute. Transferați supernatantul fără celule în două tuburi de microcentrifugă pre-etichetate de 1,5 ml și depozitați la -80 ° C
Evaluează citokinele BALF prin ELISA sau un test similar fără diluare.
Ser neutilizat și BALF la -80 ° C

5. Colorarea diferențială și evaluarea celularității BAL

6. Evaluarea histopatologiei

Pregătiți plămânii pentru evaluarea histopatologiei. După 24-48 ore de fixare a formalinei, plămânii umflați se orientează ventral și sunt încorporați în parafină. Tăiați blocurile pentru a dezvălui căile fluxului principal rezultate.
Pentru a îmbunătăți precizia de punctare, poziționați plămânii în aceeași poziție și tăiați fiecare bloc, rezultând o vizualizare longitudinală maximă a căilor respiratorii axiale intrapulmonare principale. Din acest moment, tăiați secțiuni seriale de 5 microni și colorați cu hematoxilină și eozină (H&E). Secțiuni suplimentare pot fi tăiate și pregătite pentru hibridizare in situ utilizând protocoale standard.
Evaluați histopatologia utilizând un sistem de evaluare semicantitativă bazat pe următorii parametri inflamatori, care sunt notați între 0 (absent) și 3 (sever): infiltrarea celulelor mononucleare și polimorfonucleare; Celulele epiteliale respiratorii hiperplazie și leziuni ale celulelor; Extravazare; puncții perivasculare și peribroncheolare; și procentul plămânilor implicați în inflamație. Histopatologia pulmonară trebuie evaluată de un patolog cu experiență.
Mediați toate valorile parametrilor pentru a genera un scor general de histopatologie sau utilizați scoruri individuale pentru a cuantifica aspecte specifice ale progresiei bolii. Faceți toate punctajele într-un mod dublu-orb, cu recenzenții orbi atât de genotip cât și de tratament. Sistemul de notare a fost descris anterior 6,7,10.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

Administrarea LPS induce niveluri ridicate de mediatori proinflamatori locali și sistemici, inclusiv mai multe citokine legate de răspunsul imun înnăscut. Nivelurile locale de citokine din BALF sunt evaluate utilizând tehnici convenționale precum ELISA. Citokinele obișnuite care sunt reglate în sus în plămâni după administrarea LPS includ TNF-α, IL-1β și IL-6 (Fig. 2A). Nivelurile sistemice de citokine în ser utilizând aceeași tehnică ca și estimările BALF (2 B) descris, evaluat. Nu este neobișnuit ca unii mediatori să fie prezenți în micromediul local, dar prezenți în ser. De exemplu, TNF-α se găsește în mod obișnuit la niveluri ridicate în plămâni după LPS, dar de obicei nu este detectat sistemic în condițiile descrise în acest protocol (Fig. 2A și 2 B; sub limita de detectare).

2. Expunerea respiratorie la LPS duce la niveluri crescute de citokine locale și sistemice. A) După expunerea la LPS, nivelurile locale dintr-o gamă largă de citokine proinflamatorii pot fi observate în BALF în primele 24 de ore, inclusiv TNF-α, IL-1β și IL-6. Aceste citokine pot fi evaluate cu ELISA, după cum se arată aici, la 24 de ore după expunerea la LPS. B) Mai multe citokine pot fi, de asemenea, detectate sistemic în ser. Cu toate acestea, există câteva excepții, inclusiv TNF-α, care se găsesc în concentrații mari în BALF în ser, dar nu. Citokinele de interes pentru ser trebuie evaluate empiric înainte de evaluarea la scară largă. Faceți clic aici pentru o vizualizare mai mare .

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Pașii cheie pentru evaluarea cu succes a răspunsului imun în plămânul de șoarece sunt după cum urmează: 1) selectați tulpina și sexul de șoarece adecvate pentru modelul evaluat; 2) optimizarea livrării PAMP la plămâni; 3) colectați și procesați în mod corespunzător BALF; și 4) fixați și pregătiți în mod corespunzător plămânii pentru evaluări histopatologice.

Administrarea orofaringiană sa dovedit a fi mai precisă decât alte forme de administrare a medicamentului la plămâni 2. Acest lucru se datorează în mare parte accesului direct la căile respiratorii și ocolirii problemelor asociate depunerii nazale și maxilare. Cu toate acestea, ca și în cazul tuturor testelor pe animale, necesită abilități manuale și practici extinse pentru a obține cunoștințe de management. O tehnică incorectă poate duce la pulmonare ineficiente și, în unele cazuri, la rănirea animalelor. De obicei, Evans Blue Dye (EBD) poate fi utilizat în mod eficient fie ca instrument de instruire pentru această procedură, fie pentru depanarea posibilelor probleme asociate cu depunerea 4. EBV poate fi administrat și apoi extras din țesut folosind formamidă. Cantitatea de EBD poate fi calculată utilizând niveluri de absorbanță în comparație cu o curbă standard. În mâinile noastre, recuperarea tipică a EBD variază între 90-98%. Se spune că cea mai mare parte a colorantului neabsorbit este asociată cu scurgeri în esofag. Datorită acurateței sale, tehnologia de administrare IT este ideală pentru a furniza o varietate de substanțe sensibile la doză în plămâni, precum ingrediente farmaceutice active sau organisme infecțioase.

t "> Această procedură este optimizată pentru administrarea LPS și a altor PAMP la plămânii șoarecilor. Odată ce aceste tehnici sunt stăpânite, pot fi declanșate și investigații suplimentare cu protocoale modificate pentru a evalua eficient interacțiunile gazdă-agent patogen cu agenții patogeni vii. Tehnicile descrise sunt foarte versatile și pot fi utilizate pentru orice interes de studiu în evaluarea relevanței clinice și fiziologice a unui agent experimental sau farmaceutic. Datorită acurateței dozajului, această tehnică este, de asemenea, ideală pentru investigații in vivo care necesită niveluri ridicate. Precizie în livrarea fondului.

Această procedură este optimizată pentru administrarea LPS și a altor PAMP în plămânii șoarecilor. Odată ce aceste tehnici au fost însușite, pot fi declanșate și studii suplimentare care utilizează protocoale modificate pentru a evalua în mod eficient interacțiunile gazdă-agent patogen cu agenți patogeni vii. De asemenea, tehnicile descrise aici sunt foarte versatile și pot fi aplicate oricărui studiu interesat de evaluarea relevanței clinice și fiziologice a unui agent experimental sau farmaceutic. Datorită acurateței dozei, această tehnică este necesară și pentru studiile in vivo care necesită o precizie ridicată în administrarea ingredientelor active.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Dezvăluiri

Autorii afirmă că nu există interese financiare concurente.